获得高纯度的激动型抗小鼠CD40单链抗体(scFv)，并体内外验证激动型抗小鼠CD40 scFv增强自然杀伤细胞(NK)杀伤肿瘤的作用。
亲和层析技术获得高纯度的激动型抗小鼠CD40 scFv蛋白。激动型抗小鼠CD40 scFv体外激活DC细胞，ELISA法检测培养上清中IL-12表达水平，反应CD40 scFv对DC的激活能力。将激活的DC细胞与小鼠NK细胞共培养后，将NK细胞与小鼠成纤维瘤T6-17细胞共培养，用WST-8法检测激活后NK细胞对T6-17的杀伤作用。进一步构建BALB/c裸鼠的T6-17肿瘤模型，给予CD40 scFv瘤体注射，观察对肿瘤生长抑制作用。种瘤后第20天处死小鼠，ELISA检测肿瘤组织匀浆中IL-12和IFN-γ水平。流式细胞术检测肿瘤组织匀浆中浸润NK细胞数量的变化，免疫组化法检测NKG2D表达水平的变化。
成功构建CD40 scFv-pET28a重组质粒，并经基因测序验证无误。SDS-PAGE和His-tag Western blot检测证实CD40 scFv表达成功，蛋白质相对分子质量约为27×103。CD40 scFv处理的DC细胞的培养上清中IL-12水平为(555.86±40.48) pg/ml，较对照组明显升高(P<0.05)。利用各组激活后的DC细胞培养上清刺激NK细胞后，与CD40 scFv处理的DC共培养的NK细胞对T6-17细胞的杀伤能力为(72.23±3.99)%，较对照组明显升高(P<0.05)。CD40 scFv在体内对BALB/c裸鼠的T6-17肿瘤生长有明显抑制作用，肿瘤最终生长体积相较于对照组显著降低(P<0.05)。CD40 scFv组肿瘤组织匀浆中IL-12和IFN-γ水平分别为(188.801±32.718) pg/ml和(121.428±30.994) pg/ml，均较生理盐水(normal saline，NS)组显著升高(P<0.05)。CD40 scFv组肿瘤组织NKG2D表达阳性率为(8.18±2.01)%，较NS组明显升高(P<0.05)。
激动型CD40 scFv可以通过DC细胞增强NK细胞的抗肿瘤能力。
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免疫治疗是目前针对恶性肿瘤的一种新兴治疗手段，旨在利用患者自身免疫系统的抗肿瘤作用来达到抑制甚至杀灭肿瘤的目的[1]。激动型CD40抗体通过外源激活DCs的第二信号系统，促进DCs的活化与成熟，使其分泌更多的白细胞介素-12(interleukin-12，IL-12)并诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的产生，同时可以通过改变肿瘤微环境中的免疫细胞激活状态和细胞因子的水平来抑制肿瘤的生长，作为一种免疫调节型抗体而发挥抗肿瘤作用[2]。同时，有研究发现在肿瘤微环境中，活化的DC细胞可以通过激活NK细胞发挥抗肿瘤作用[3]。但是，激动型CD40抗体在实际应用中所介导的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)会对机体产生药物毒性及副作用[4]，而单链抗体相较于单克隆抗体，保留了其与抗原特异性结合的可变区的同时去掉了Fc段，不会引起ADCC。因此，本文通过构建激动型CD40单链抗体(scFv)探讨激动型CD40 scFv是否可以在体内外增强NK细胞抗肿瘤作用。
