近些年，冠状病毒(coronavirus，CoV)感染导致的疫情屡屡暴发，包括重症急性呼吸综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)以及新型冠状病毒肺炎(COVID-19)，对公共卫生造成了持续威胁。CoV感染可诱发机体产生一系列免疫应答，包括固有免疫、体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫等。这些免疫应答不仅对机体抑制和消灭病毒入侵至关重要，在免疫病理和疾病重症化的过程中也扮演着重要角色。深入理解免疫应答在免疫保护和免疫病理中的双重作用，将有助于阐释CoV的致病机制和调控免疫保护和免疫病理间的平衡，促进CoV疫苗的成功研发。本文综述了免疫应答在高致病性CoV感染中的双重作用，对其在CoV新型疫苗研发中的启示作用进行了讨论和展望。
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冠状病毒(coronavirus，CoV)可感染人、鼠、猪、猫、犬、禽类等脊椎动物，引起宿主呼吸道、肠道、肝和神经系统等疾病。近些年，由于种种原因导致CoV跨越物种屏障，陆续暴发了严重急性呼吸系统综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)、中东呼吸系统综合征(Middle East respiratory syndrome, MERS)以及新型冠状病毒肺炎(COVID-19)三次严重呼吸道感染性疾病。这三次疫情均波及全球，给人类健康和社会经济造成了巨大危害，已成为公共卫生和社会稳定的严重威胁。SARS-CoV、MERS-CoV以及2019新型冠状病毒(2019-nCoV)均为高致病性人类CoV，主要感染人呼吸道上皮细胞，可导致弥漫性肺泡损伤、肺炎、严重急性呼吸综合征和多器官衰竭等，甚至死亡。
CoV感染可诱发机体产生一系列免疫应答，包括固有免疫、体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫等。然而，这些免疫应答在控制病毒感染复制中的作用尚未完全阐明。机体抵御CoV感染的过程中，首先通过单核-巨噬细胞激活干扰素信号通路，诱发固有免疫应答，进而激活适应性免疫应答，产生中和抗体中和病毒及细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)杀伤靶细胞；同时也逐步激活多种分泌炎症因子的单核-巨噬细胞、树突状细胞、上皮细胞、淋巴细胞等，导致炎症风暴的形成，进而出现疾病重症化结局，而且还存在抗体介导的感染增强(antibody-dependent enhancement, ADE)、病理性T细胞的异常激活等一系列复杂的免疫病理现象(图1)。因此，深入理解这些免疫应答在免疫保护和免疫病理过程中起到的双重作用，将有助于阐释CoV的免疫机制和致病机制，指导研发更加安全有效的CoV疫苗。
注：Mø：巨噬细胞；DC：树突状细胞；ILL：固有淋巴细胞；ILC：固有淋巴样细胞；Th：辅助性T淋巴细胞；B：B淋巴细胞；CTL：细胞毒性T细胞；Plasma：浆细胞；ADE：抗体介导的感染增强；GM-CSF:粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子
固有免疫是宿主抵御病原体入侵的第一道防线，在高致病性CoV的感染早期，机体的固有免疫细胞通过Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs) 、RIG-I样受体(RIG-like receptors, RLRs)及NOD样受体(NOD-like receptors, NLRs)等模式识别受体识别病毒RNA等病原体相关模式分子(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)后，招募接头蛋白，启动涉及多个激酶的固有免疫信号通路，激活IRF3、NF-κB和AP-1等关键转录因子[1]，这些转录因子可以协同促进Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)的产生，通过干扰素与干扰素-α/β受体(IFNAR)结合，诱导大量干扰素刺激基因(ISGs)介导抗病毒活性，激活促炎症细胞因子的表达。同时，高致病性CoV进化出了延缓IFN产生的多种策略，例如SARS-CoV、MERS-CoV的结构蛋白(M和N)、非结构蛋白(NSP1和NSP3)以及辅助蛋白(3b、6、9b、4b)均被鉴定为干扰素拮抗剂[2,3,4,5,6]。有研究报道，MERS-CoV感染1 d后给予IFN-Ⅰ治疗可以有效降低病毒载量并减轻肺损伤；然而感染2 d后给予IFN-Ⅰ治疗不仅没有降低病毒载量，反而加重了肺损伤[7]，这可能是IFN-Ⅰ信号传导的延迟促进了炎性单核-巨噬细胞的积累，从而导致了肺细胞因子、趋化因子水平升高、血管渗漏和病毒特异性T细胞应答受损的结果[8]。
固有免疫细胞分泌的细胞因子和趋化因子对于局部组织抵抗感染是必要的，但过度的炎症反应，即"细胞因子风暴"，也在高致病性CoV感染者的病程恶化中起着重要作用。在SARS、MERS和COVID-19患者体内均发现了过度表达的细胞因子和趋化因子，这些患者的肺部均出现了弥漫性肺泡损伤的组织学特征[9,10]。病理报告显示，COVID-19患者的两肺中均可见以淋巴细胞为主的间质性单核炎性浸润，肺泡内腔中出现非典型的肺炎细胞，表现出病毒性细胞病变[11]。最新的临床相关研究证据也表明，COVID-19重症患者血清中IL-2、IL-7、IL-10、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、CXCL10/IP-10、CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1α及TNF-α的水平比非重症患者更高，提示患者感染后的细胞因子风暴与疾病的严重程度相关[12,13]。Xiong等[14]对3例COVID-19患者的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)和外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)转录组进行分析，发现患者BALF中IL-10、CXCL10、CCL2、CCL3、CCL4的表达比健康者显著升高，PBMCs中IL-10、IL-18、CXCL10显著增高，揭示COVID-19的发病机制与过度炎症反应存在关联。此外，有研究团队对33例COVID-19患者血液的30项免疫学指标进行了分析，发现粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-6等可能是引发细胞因子风暴的关键炎症因子。随后的小规模临床试验也证明，靶向IL-6受体的托珠单抗可有效减缓和阻断患者体内的细胞因子风暴，使病情出现好转。但是，有关高致病性CoV感染机体后诱发严重炎症反应的机制尚不清楚，一些研究表明干扰素信号的延迟[8]、病毒的快速复制[15]以及宿主细胞表面血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)的降低[16]可能与过度炎症反应有关。因此，在评估CoV疫苗的同时也要注重是否会诱发严重炎症应答等不良作用。
黏膜免疫系统，也称为黏膜相关淋巴组织(mucosal-associated lymphoid tissue，MALT)，是机体抵抗病原体入侵的固有免疫屏障。黏膜固有层富含巨噬细胞、树突状细胞和淋巴样细胞等免疫细胞，健康成人的MALT所含有的免疫细胞占整体免疫细胞数量的80%左右[17]。流感病毒、CoV、HIV、脊髓灰质炎病毒等可分别通过呼吸道、生殖道和胃肠道等黏膜表面入侵机体。机体受感染后，可诱导循环中的单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞迁移到黏膜感染部位，使其成为免疫应答发生的关键组织。机体的MALT可通过物理屏障、固有免疫、适应性细胞免疫应答以及分泌性IgA(sIgA)抗体，为宿主抵御这些病原体的入侵提供第一道防线。sIgA是机体黏膜局部抗感染免疫的主要抗体，较高的sIgA和血清中和抗体滴度与病毒载量较低以及肺部病理损伤较小有关[18]。尽管黏膜固有免疫细胞有助于病毒清除，但它们也可能充当避难所和媒介为病毒提供逃避宿主黏膜固有免疫并全身传播的机制。有研究者在猕猴中观察到SARS-CoV感染2 d内，可穿过呼吸道黏膜，导致T淋巴细胞、MAC387＋和CD163＋单核-巨噬细胞广泛的黏膜浸润，感染的单核细胞分化为树突状细胞等抗原提呈细胞(antigen-presenting cell, APC)，这些受感染的APC随后迁移到引流淋巴组织，并和游离的病毒一起感染新的靶细胞，导致全身性病毒传播[19]。
因此，有效的高致病性CoV疫苗除了诱导系统免疫应答，还应诱发出足够强度的黏膜免疫应答，从而更有效地抑制病毒在呼吸道黏膜表面的感染和入侵。MALT的激活取决于抗原能否准确递送到黏膜淋巴组织，然而由于常规的抗原形式不易突破黏膜表面的黏液层，口腔、胃肠道等黏膜系统对抗原的强力消化降解，使黏膜疫苗的抗原摄取能力不足而导致免疫应答水平较低，因此有效的黏膜疫苗通常需要合适的黏膜免疫途径、载体或佐剂来增强其免疫效果。例如，鼻腔黏膜作为疫苗接种部位可以通过与鼻咽相关淋巴组织相互作用来刺激呼吸道黏膜免疫，与肌肉注射和皮下免疫相比，鼻腔免疫产生的局部体液免疫应答及CTL反应更强[18,20,21]。Bukreyev等[22]以及Foxwell和Cripps[23]在非洲绿猴模型中证明表达S蛋白的减毒3型牛/人副流感病毒载体黏膜疫苗进行一次鼻内免疫，可产生针对SARS-CoV的中和抗体和保护效应。此外，已发现胞壁酰二肽(MDP)、Poly(I∶C)、氢氧化铝、Δ菊粉、CpG等物质可作为黏膜佐剂激活TLR，以增强局部黏膜免疫和全身适应性免疫[24,25,26]。例如，MERS-CoV S蛋白疫苗与铝佐剂共同使用时可诱导偏向Th2型的免疫应答，而与CpG ODN和菊粉等佐剂共同使用时可产生更均衡的Th1/Th2型免疫应答[27,28]。SARS-CoV灭活疫苗与改良的Poly(I∶C)佐剂通过鼻内接种可诱导强烈的抗SARS-CoV黏膜免疫应答[29]。
前期研究表明针对表面刺突糖蛋白(S)的高滴度中和抗体可能与患者的预后呈相关性[30]，在多种动物模型中(包括小鼠、雪貂、仓鼠和猕猴)证明针对S蛋白的中和抗体可以降低CoV在易感宿主中的感染和复制[31,32]。研究表明SARS-CoV S蛋白的RBD区域含有特异的空间构象B细胞表位，能够高效诱导出中和抗体，并有效保护SARS-CoV的攻击[33,34,35,36,37]。抗体中和SARS-CoV的主要机制是通过阻止病毒与细胞受体ACE2之间的相互作用[38]。多项研究表明，针对S蛋白的中和抗体，可以保护动物免受同源SARS-CoV或MERS-CoV攻击，但对于此类抗体是否对2019-nCoV有交叉反应尚有争议。Chan等[39]研究认为恢复期SARS患者血清中可能含有针对其他β属CoV的交叉反应抗体，但随后Du等[40]研究指出在接种疫苗的个体中，一系列SARS-CoV S蛋白RBD区域的血清特异性单克隆或多克隆抗体与MERS-CoV不发生交叉反应。最近，基于生物信息算法对2019-nCoV及SARS-CoV的S蛋白进行的分析表明，两种病毒S蛋白之间存在潜在的交叉保护抗原表位[41,42]，同时，也有研究指出恢复期SARS患者的血清可阻止2019-nCoV感染细胞[43]。但最新一项研究发现3种SARS-CoV S-RBD特异性单克隆抗体(S230、m396、80R)与2019-nCoV S蛋白没有明显的结合，认为针对这两种病毒RBD的抗体交叉反应性可能较低[44]。因此，SARS-CoV S抗原特异性抗体对2019-nCoV是否具有交叉保护性仍需进一步研究确证。
然而，不可忽视的是SARS的S特异性抗体也可能在CoV的致病过程中起到重要作用。例如，研究发现SARS死亡患者感染早期的血清中抗S中和抗体滴度很高，而抗N蛋白抗体水平却非常低。相比之下，SARS康复者体内的抗S中和抗体产生速度很慢，但抗N蛋白抗体却能更快产生[30]。还有研究显示基于SARS-CoV全长S抗原的疫苗可能会产生有害的免疫应答，包括观察到的ADE现象，并诱导增加嗜酸性粒细胞促炎症反应，使动物对SARS-CoV更易感，从而引起更严重的肝脏损害和死亡[45,46,47]。有研究认为针对S蛋白RBD的单克隆中和抗体可以结合病毒S蛋白并使其空间构象发生变化，被暴露的S2亚基更易被蛋白酶裂解而利于病毒入侵；同时，抗体与靶细胞表面的Fc受体结合，抗体Fc受体复合物在功能上模仿病毒受体介导病毒进入细胞[48]。此外，222例[49]和173例[50]COVID-19患者住院期间的血浆分析结果表明病情严重者的IgG免疫应答增强且总抗体效价较高，这可能与患者预后较差有关，提示2019-nCoV感染也可能存在ADE作用。有学者认为，针对SARS-CoV S抗原的特异性IgG抗体可通过Fc片段与巨噬细胞、树突状细胞等表面的FcγR结合而促进CCL2、IL-8等炎症因子的产生，进而招募和活化大量的单核-巨噬细胞在肺部聚集，从而抑制伤口愈合和导致致命的急性肺损伤，因此建议在急性感染过程中调节抗S蛋白的抗体反应或者封闭阻断Fcγ受体可能会有效减缓此类病毒感染的临床症状[47]。
抗CoV，尤其是抗高致病性CoV S蛋白的特异性抗体，在病毒感染过程中可能扮演着双重作用(中和病毒并阻止其入侵细胞引起感染，以及增强病毒感染免疫细胞而诱发免疫病理)。因此，基于S蛋白抗原疫苗的安全性需要更加谨慎地评价和深入研究。鉴定潜在的保护性抗原表位将对CoV疫苗的抗原设计非常重要，寻找具有广谱交叉保护作用的抗原表位，同时去除可能引起有害免疫应答的抗原表位，将是研发此类疫苗的重要研究方向。
在SARS、MERS和COVID-19患者的临床病理解剖中发现，多个免疫组织器官中T淋巴细胞数量显著降低[9,11,51]，而且CTL反应强度与疾病的严重程度呈负相关[52]，这提示抗原特异性T细胞应答对于识别和清除CoV感染细胞非常重要。研究显示，抗原特异性T细胞应答在SARS幸存者中可维持11年[53]。尽管产生的记忆性T细胞应答是否足以防止再次感染还需要进一步研究，但已有研究证明针对免疫优势表位的特异性记忆CD8＋T细胞应答可有效保护小鼠免受SARS-CoV感染[54,55]。CD4＋T细胞可分为Th1、Th2细胞亚群，Th1细胞分泌IFN-γ、TNF-α、TNF-β和IL-2增强CD8＋T细胞毒性，刺激NK细胞，参与细胞免疫调节，在抗病毒免疫中发挥重要作用。Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13，介导体液免疫应答，诱发抗体产生。研究表明，CD4＋T细胞耗竭可导致肺部炎症病理的增强和SARS-CoV从肺内清除的延迟等，因此CD4＋T细胞在控制疾病发生和SARS-CoV复制中也起到重要作用[56]。相比于抗体应答，诱导T细胞免疫应答的抗原表位更为保守，因此这些T细胞免疫应答的交叉反应能力更强。S、N、M和E蛋白是CoV的主要结构蛋白，都包含大量的CTL抗原表位[52]，其中S蛋白介导CoV与受体的结合以及膜融合，是CoV疫苗研发中最常采用的靶标；N蛋白是病毒RNA合成所必需的，其序列更为保守，而且也具有高度的免疫原性从而诱发强烈的特异性抗体和T细胞应答。例如免疫SARS-CoV N蛋白抗原后，可在实验动物的呼吸道中诱导产生与其他CoV N抗原表位有交叉反应的记忆性T细胞，在遇到同源或异源病毒攻击时可快速发挥保护作用[54]。因此，S、N、M和E蛋白等T细胞免疫应答表位也应成为研发CoV疫苗的重要考虑方向。
同样，T细胞应答在免疫病理中也可能发挥了一定作用。例如，COVID-19患者外周血中CD4＋T、CD8＋T和CD19＋B细胞数量均显著减少，但处于高度激活的状态，CD4＋T细胞中促炎性CCR4＋CCR6＋ Th17细胞比例增加，CD8＋T细胞内具有高浓度的细胞毒性颗粒[11]。另一研究团队也指出COVID-19患者感染早期，CD4＋T细胞被迅速激活，产生大量GM-CSF、IL-6等细胞因子，GM-CSF进一步激活CD14＋CD16＋炎症性单核细胞，产生更大量的IL-6和其他炎症因子，形成炎症风暴，导致严重肺部和其他器官的免疫损伤。这些表明以Th17、CD4＋T和CD8＋T细胞的高细胞毒性为特征的T细胞过度反应，可能是COVID-19患者发生严重免疫损伤的重要原因之一[11]。研究还发现记忆性CD8＋T细胞一方面产生效应细胞因子和细胞溶解分子，降低肺内病毒载量[28]，另一方面也可能引起Ⅰ型干扰素和炎性单核细胞、巨噬细胞反应失调，进而导致感染SARS-CoV的小鼠死于致死性肺炎[8]。最近一项研究表明MERS-CoV感染下调编码Th1、Th2细胞因子和趋化因子的基因，只有6种Th1相关细胞因子和趋化因子(IL-18、IL-18R1、SOCS5、CCR2、CD4和CXCR3)在MERS-CoV感染者肺中过表达，这些高表达的炎症因子可能在MERS-CoV感染患者的免疫病理、严重程度和病死率中起重要作用[57]。这种Th1和Th2细胞因子、趋化因子的失衡可能导致病理改变、感染清除效率低下以及宿主对免疫介导性疾病的易感性。Th17细胞是不同于Th1和Th2细胞的T辅助细胞群，可通过STAT3和NF-κB信号通路产生IL-17和IL-23等细胞因子，这些Th17细胞因子可将中性粒细胞和单核细胞募集到感染或炎症部位，并增强其他细胞因子和趋化因子如IL-6、IL-1β、IL-8、TGF-β、TNF-α、CCL2的产生，从而介导炎症应答[58]。因此，这一作用也可能是CoV患者出现免疫病理损伤的原因之一。这些研究数据提示在设计CoV疫苗时必须要考虑诱导的T细胞反应强度和类型，Th1/Th2免疫应答平衡将有助于提高疫苗保护效果，避免出现免疫病理增强现象。
人CoV疫苗的技术路线包括灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、mRNA疫苗、重组载体疫苗等。(1)灭活疫苗：易于制备，生产工艺成熟。研究表明SARS-CoV灭活疫苗可诱导高滴度的中和抗体，并有效预防SARS-CoV对食蟹猴的感染[59]。2004年，我国完成了SARS灭活疫苗的Ⅰ期临床研究，结果表明其安全性良好，可在志愿者体内产生SARS-CoV特异性中和抗体[60]。但也有研究发现，接种SARS-CoV灭活疫苗的小鼠在被病毒感染时更易出现偏向Th2型免疫病理的肺部病变[61]。因此，在评估灭活疫苗时，需要注意其安全性问题。目前，中国生物武汉生物制品研究所有限责任公司研发的COVID-19灭活疫苗已进入Ⅱ期临床试验阶段。(2)减毒活疫苗：能够诱发全面稳定持久的体液、细胞和黏膜免疫应答。已经开发了一些减毒突变株，如SARS-CoV E减毒突变体[62]、SARS-CoV ExoN减毒突变体[63]、NSP16减毒突变体和ORF减毒突变体，在实验动物体内均可产生高水平的中和抗体，并能阻止病毒在呼吸道中的感染和复制。但是，其安全性问题使其难以被应用于临床，包括减毒毒株的回复突变以及与野生型CoV重组的风险。(3)亚单位疫苗：具有较好的安全性，不过由于全长蛋白质抗原中通常含有免疫优势的非保护性的抗原表位，从而诱导机体产生大量没有中和活性的抗体，因此通过合理改造和设计亚单位疫苗的空间结构，去除这些非保护性的优势抗原表位，将更有效提高亚单位疫苗的保护效果[64]。例如，接种SARS-CoV S蛋白RBD Fc疫苗可诱导小鼠产生高滴度的特异性中和抗体，且接种疫苗的小鼠肺组织中未发现明显的组织病理学变化。在非人灵长类动物模型中，接种重组RBD亚单位疫苗可诱发强烈而持久的免疫应答，有效降低肺脏内MERS-CoV病毒载量，减轻肺炎和组织损伤[65]。(4)DNA疫苗和mRNA疫苗：二者属于核酸疫苗技术，可以同时引起细胞免疫和体液免疫。例如，编码SARS-CoV S糖蛋白的DNA疫苗在小鼠模型中诱导T细胞和中和抗体反应，产生保护性免疫[31]。一项在10名健康成年人中的临床试验表明编码SARS-CoV S基因的DNA疫苗可有效诱导出中和抗体和细胞免疫应答[66]。然而，DNA疫苗免疫原性较低，已有研究采用不同的免疫途径或佐剂提高其免疫原性。例如，针对SARS-CoV的DNA疫苗通过电穿孔技术可刺激小鼠产生更高水平的细胞和体液免疫应答[67]。另一种编码MERS-CoV S基因的DNA疫苗(GLS-5300)，近期也已经在美国和韩国完成了Ⅰ期临床研究，显示了良好的安全性和免疫原性[68]。mRNA疫苗的生产过程是基于体外系统的，不需要在细菌或细胞培养物中进行扩增，因此生产速度更快且易于质量监测，从而比传统疫苗技术更加适合用于新发突发传染病的应急疫苗研发[69]。目前，针对2019-nCoV的DNA疫苗(INO-4800)和mRNA疫苗(mRNA1273)均已经开展了Ⅰ期临床试验。(5)重组病毒载体疫苗：能够有效诱发机体黏膜免疫应答和系统免疫应答，因此被广泛用于高致病性CoV疫苗的研发中。腺病毒、痘病毒、水疱性口炎病毒[70]、麻疹病毒[71]、新城疫病毒[72]、副流感病毒[73]等均被作为载体用于研发高致病性CoV疫苗。例如，携带SARS-CoV S抗原基因的改良型天坛株痘病毒载体疫苗可高效诱导小鼠产生抗S中和抗体[74]。表达MERS-CoV S蛋白的改良型安卡拉痘病毒载体疫苗可有效保护单峰骆驼免受MERS-CoV感染[75]。对小鼠单次肌内注射表达MERS-CoV S蛋白的重组腺病毒载体疫苗，可在脾脏和肺部淋巴细胞诱发功能性抗原特异的T细胞应答和抗体应答，并持续数月之久[76]。目前，表达MERS-CoV S抗原基因的复制缺陷型黑猩猩腺病毒(ChAdOx1)载体疫苗(MERS001)，已开展了Ⅰ期临床试验。表达S蛋白的5型腺病毒载体疫苗(Ad5-nCoV)正在开展Ⅱ期临床试验。
高致病性CoV感染后导致机体产生一系列免疫应答，在机体抵御病毒感染和机体免疫病理、疾病重症化的过程中起到双重作用。了解高致病性CoV的发病机制和免疫保护作用将有助于开发安全有效的CoV疫苗。基于对CoV所诱发的免疫应答和致病机制的认识和总结，一个理想的CoV疫苗应该具备以下特点：(1)合适的抗原选择和抗原种类配伍，兼顾保守性和功能性，去除可能引起有害免疫应答的抗原表位，寻找具有广谱交叉保护作用的抗原表位，将是研发CoV疫苗的重要研究方向。(2)同时诱发体液免疫和细胞免疫应答强度和类型，将有助于提高疫苗保护效果。(3)采用合适的递送系统以及合适的佐剂或免疫调控剂，以诱导出高水平的黏膜免疫应答，并均衡调控疫苗诱发的Th1/Th2型免疫应答，避免出现免疫病理增强现象。
