动态监测COVID-19确诊患者SARS-CoV-2感染后体内特异性IgM和IgG抗体的变化特点,并分析其临床意义。
收集2020年1月8日至2月21日在河南省疾病预防控制中心核酸检测阳性的56例COVID-19确诊患者不同病程的168份血清样本,已排除COVID-19的25例健康人群的血清样本作为对照组,采用化学发光法检测SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体。
IgM抗体在发病后1~3周急剧上升,在发病后第3周达到峰值(21.78 AU/ml);IgG抗体在发病后3~6周上升幅度最大,在发病后第9周达到峰值(81.58 AU/ml); IgM和IgG抗体水平与患者年龄和病程密切相关(P<0.05)。其中30~60岁组抗体水平最高,急性期、既往感染IgM抗体阳性率与抗体水平低于恢复期,急性期IgG抗体阳性率与抗体水平均低于恢复期和既往感染;在整个病程中,IgM和IgG抗体水平总体呈现急性期逐渐升高、恢复期达到高峰、既往感染下降并维持在一定水平的趋势。
血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体检测可作为COVID-19的辅助诊断指标,对其连续观测有助于流行病学调查、血清学诊断及病程监测。
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新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的新发急性呼吸道传染病,具有极强的传染性[1]。该病尚无特效治疗药物,早发现、早诊断是控制疫情的关键[2]。在国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》中,COVID-19确诊标准在原有核酸检测的基础之上增加了抗体检测[3]。机体感染SARS-CoV-2后可引起适应性体液免疫应答,通过检测感染者血液中特异性IgM、IgG抗体可间接判断机体是否携带病毒。其中IgM抗体一般在感染初期产生,提示近期感染,IgG抗体为病原体刺激效应细胞二次应答后产生的抗体,可提示感染进入恢复期或既往感染[4]。但以上只是一个普遍规律,SARS-CoV-2作为一种新出现的病毒,病程中特异性抗体应答规律尚不清楚。因此,本研究基于化学发光免疫分析技术,定量检测COVID-19患者血清样本中SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体,分析急性期、恢复期和既往感染患者体内抗体水平变化特点,为COVID-19的预防、诊断和流行病学调查提供参考依据。
收集2020年1月8日至2月21日在河南省疾病预防控制中心核酸检测阳性的56例COVID-19确诊患者不同病程(急性期、恢复期和既往感染)的168份血清样本,病例的最长观察期为207 d。此外,以河南省疾病预防控制中心排除COVID-19的25例健康人群的25份血清样本作为对照组。诊疗标准符合《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》[3]。所有入选人员均签署书面知情同意书。
所有研究对象均采集空腹静脉血5 ml,置于含分离胶的黄头真空采血管内,室温静置待血液凝固,1 500~2 000 r/min离心10 min,取血清备用。血清检测前应于56℃灭活30 min。24 h内检测的样本置于4℃冰箱中保存,24 h内不能及时检测的样本置于-20℃及以下冰箱中保存。操作者在严格防护下按《新型冠状病毒实验室生物安全指南(第二版)》进行实验操作[5]。
以COVID-19确诊患者开始出现临床症状(发热或咳嗽)计为发病。采集56例确诊患者3个病程的血清样本,包括急性期(发病后1~21 d,核酸检测为阳性)、恢复期(发病后28~63 d,核酸检测转阴)和既往感染(发病后175~210 d,核酸复查阴性)。对血清样本进行IgM和IgG抗体的连续监测,并进行动态变化分析。
新型冠状病毒特异性IgM和IgG抗体检测试剂盒购自安图生物股份有限公司,IgM抗体检测试剂盒货号为20200617、20201023、20201223, IgG抗体检测试剂盒货号为20200612、20200618、20201023;检测仪器为AutoLomo A2000 PLUS化学发光测定仪。
采用磁微粒化学发光法检测SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体,IgM采用捕获法原理进行检测,IgG采用间接法原理进行检测。磁珠包被的抗原成分均为SARS-CoV-2重组抗原。按试剂盒和仪器说明书进行操作,每次实验均同时检测阳性质控品和阴性质控品。阳性判断值(Cut off)=阳性对照孔平均发光值×0.2。S/CO=待测样本发光值/Cut off值,当S/CO≥1.00时,检测结果判为阳性;S/CO<1.00时,检测结果判为阴性。当抗体浓度处于临界状态时,对样本进行复测(重复性较好),取均值分析。
采用SPSS22.0统计软件进行分析,根据资料是否呈正态分布,采用均值±标准差或P50 (P25,P75)描述,其中IgM和IgG抗体水平资料不呈正态分布(经对数转换后呈正态分布)。采用χ2检验进行抗体阳性率之间的差异比较;采用广义估计方程对IgM和IgG抗体水平变化作多因素分析,以排除重复测量对结果的影响。
56名COVID-19确诊患者中,男性26人,女性30人。轻症患者13人,普通患者42人,重症患者1人。患者年龄平均为47.54±11.56岁,<30岁有3人,30~60岁有40人,>60岁有13人。其中,26.79%患者有高血压、心血管疾病、肺部疾病等既往病史。在临床症状和体征中,83.93%以上患者起病有发热症状,30%以上患者有干咳、乏力和咳痰等症状。
IgM和IgG抗体阳性率如表1所示,发病后第1周,IgM和IgG抗体阳性率较低,分别为47.06%、88.24%。发病后第5周IgG抗体全部阳转,发病后第6周IgM抗体全部阳转。进一步分析患者在不同病程IgM和IgG抗体阳性率差异,IgM抗体在急性期阳性率为57.14%,之后逐渐转阳,在恢复期最高(94.64%),既往感染呈转阴趋势(69.46%)。IgG抗体在急性期阳性率为85.71%,恢复期上升至100%,在既往感染中仅有1例抗体转阴,其他均为阳性,且抗体阳性率保持在较高水平(98.21%)。不同病程SARS-CoV-2 IgM抗体阳性率比较差异有统计学意义(χ2=23.64,P<0.05), IgG抗体阳性率比较差异有统计学意义(χ2=11.33,P<0.05)。其中,急性期、既往感染IgM抗体阳性率低于恢复期,急性期IgM抗体阳性率与既往感染相比差异无统计学意义;急性期IgG抗体阳性率低于恢复期和既往感染,恢复期IgG抗体阳性率与既往感染相比差异无统计学意义。
病程 | 标本采集距发病天数 | 标本数量(n) | IgM抗体 | IgG抗体 | |||
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阳性率(%) | 抗体水平(AU/ml) | 阳性率(%) | 抗体水平(AU/ml) | ||||
急性期 | 第1周(1~7 d) | 34 | 47.06 | 0.75 | 88.24 | 2.16 | |
第2周(8~14 d) | 16 | 68.75 | 7.68 | 81.25 | 6.72 | ||
第3周(15~21 d) | 6 | 83.33 | 21.78 | 83.33 | 9.62 | ||
恢复期 | 第5周(28~35 d) | 8 | 87.50 | 5.60 | 100.00 | 51.44 | |
第6周(36~42 d) | 4 | 100.00 | 15.82 | 100.00 | 70.60 | ||
第7周(43~49 d) | 18 | 94.44 | 10.33 | 100.00 | 59.75 | ||
第8周(50~56 d) | 20 | 95.00 | 6.68 | 100.00 | 45.53 | ||
第9周(57~63 d) | 6 | 100.00 | 14.07 | 100.00 | 81.58 | ||
既往感染 | 第26周(175~182 d) | 4 | 50.00 | 1.54 | 100.00 | 5.17 | |
第27周(183~189 d) | 8 | 75.00 | 2.03 | 87.50 | 22.76 | ||
第28周(190~196 d) | 20 | 65.00 | 2.20 | 100.00 | 18.67 | ||
第29周(197~203 d) | 20 | 75.00 | 1.48 | 100.00 | 15.17 | ||
第30周(204~210 d) | 4 | 75.00 | 3.22 | 100.00 | 23.77 | ||
总计 | |||||||
急性期 | 第1~3周(1~21 d) | 56 | 57.14 | 2.01 | 85.71 | 2.48 | |
恢复期 | 第5~9周(28~63 d) | 56 | 94.64 | 7.40 | 100.00 | 59.16 | |
既往感染 | 第26~30周(175~210 d) | 56 | 69.64 | 1.66 | 98.21 | 16.99 |
IgM和IgG抗体中位数如表1所示,发病后第1周,IgM和IgG抗体中位数最低,分别为1.46 AU/ml、2.16 AU/ml。IgM抗体在发病后1~3周急剧上升,在发病后第3周(急性期)达到峰值(21.78 AU/ml);IgG抗体在发病后3~6周上升幅度最大,在发病后第9周(恢复期)达到峰值(81.58 AU/ml)。
发病后患者血清IgM和IgG抗体水平变化情况如图1所示,不同病程中,IgM抗体中位数分别为2.01 AU/ml、7.40 AU/ml、1.66 AU/ml,IgG抗体中位数分别为2.48 AU/ml、59.16 AU/ml、16.99 AU/ml。以患者性别、疾病分型、年龄、有无既往病史、病程为自变量,以病程为重复测量因素,并分别以IgM(对数转换)和IgG(对数转换)抗体水平为因变量,采用广义估计方程进行多因素分析。结果排除重复测量和混杂因素影响后,年龄组IgM和IgG抗体水平差异有统计学意义(Wald检验χ2=27.64,P<0.05;Wald检验χ2=15.41,P<0.05),30~60岁组IgM和IgG抗体水平最高;不同病程组IgM和IgG抗体水平差异有统计学意义(Wald检验χ2=131.9,P<0.05;Wald检验χ2=195.52,P<0.05),其中急性期、既往感染IgM抗体水平低于恢复期,急性期IgG抗体水平均低于恢复期和既往感染。
SARS-CoV-2抗体检测是一种新的检测方法,需要验证试剂的可靠性和明确特异性抗体产生的规律,使SARS-CoV-2抗体检测结果更科学和准确地应用于临床。本研究表明,急性期IgM和IgG抗体检测临床敏感度分别为57.14%(32/56)和85.71%(48/56),健康人群血清样本IgM和IgG抗体均无假阳性,即特异度为100%。由此可见,相对于临床症状和SARS-CoV-2核酸检测,IgM和IgG抗体检测与临床诊断结果虽尚不能达成完全一致,但仍具有较好的临床特异度和敏感度,可以作为COVID-19筛查和诊断的辅助诊断指标。
IgM抗体在发病后1~3周急剧上升,在发病后第3周达到峰值(21.78 AU/ml),IgG抗体在发病后3~6周上升幅度最大,发病后第9周达到峰值(81.58 AU/ml),并在发病30周后仍具有较高的水平(16.99 AU/ml),提示SARS-CoV-2特异性抗体的达峰时间较晚,这与徐云云等[6]、罗效梅等[7]和吴满辉等[8]研究一致。本研究与机体免疫应答规律相一致:IgM抗体先升高后降低,IgG抗体出现晚于IgM抗体,可存在较长时间,产生的IgG抗体是否具有保护性还需检测中和抗体进一步验证。
研究显示[4],在恢复期、既往感染中,核酸检测阴性,IgM检测阴性、IgG检测阳性提示患者可能既往感染SARS-CoV-2,但已恢复或体内病毒被清除,免疫应答产生的IgG抗体维持时间长,仍存在于血液中而被检测到;核酸检测阴性,IgM检测阳性、IgG检测阳性,提示患者近期曾感染SARS-CoV-2并处于恢复期,体内病毒被清除,IgM尚未减低至检测下限;或核酸检测结果假阴性,患者处于感染活跃期。在本研究中,从确诊病例核酸转阴进入恢复期后,SARS-CoV-2 IgM抗体阳性率逐渐降低,至既往感染抗体阳性率为69.64%,而IgG仍然具有较高的阳性率(98.21%),且在恢复期、既往感染IgM抗体阳性的患者,其IgG抗体也为阳性。这与感染病毒后人体出现IgM和IgG抗体的变化规律一致,随着治疗或病程的转归,IgM抗体浓度逐渐降低,而IgG抗体浓度会维持一段时间,表明患者已经产生相应的免疫力,并正向痊愈方向发展。
本研究发现,在整个病程中,COVID-19患者IgM抗体阳性率和抗体水平均低于IgG,IgM抗体全部阳转时间晚于IgG,李萍等[9]也有相同的研究结论。SARS的血清学诊断研究结果表明,在疾病的早期IgG抗体阳性率比IgM抗体阳性率高[10,11]。这与一般传染病的IgG类抗体出现规律不一致,分析其原因可能与以下因素有关:(1)结合流行病学调查和密切接触史,推测这些病例感染SARS-CoV-2的时间可能更早,IgM抗体阳性率要低于实际值,而IgG抗体阳性率可能要高于实际值;(2)此现象可能由SARS-CoV-2抗体动力学变化的特殊性所导致,需大样本的临床数据和可靠试剂来验证;(3)COVID-19是一种新型传染病,其血清学诊断方法亦处于初始阶段,检测结果可能存在一定的假阳性。因此,此结果有待于进一步研究。
相关研究显示[12,13],COVID-19患者体内特异性抗体水平和患者的病情进展有着重要关系,且体液免疫应答强度与疾病严重程度成正比。但在本研究中,重型和普通型患者的IgM和IgG抗体与轻型患者相比差异没有统计学意义,与之前的研究不符,这可能与样本数较少有关。本研究中,COVID-19患者多为中老年人,且30~60岁组IgM和IgG抗体水平最高,性别间的IgM和IgG抗体水平没有显著性差异。分析原因可能为中老年人免疫器官功能衰退,免疫功能下降,更易发生感染,但中老年人往往具有较高比例的记忆性淋巴细胞,在病毒侵袭时,可迅速活化产生免疫性抗体,产生较高水平的特异性抗体。进一步分析不同病程患者IgM和IgG的抗体水平,结果显示IgM和IgG抗体水平在急性期呈上升趋势,在恢复期时最高,28名患者(50%)恢复期IgG抗体滴度较急性期有4倍及以上升高。IgM和IgG抗体水平在急性期逐渐升高、恢复期达到高峰、既往感染下降并维持在一定水平。
综上所述,在COVID-19全球范围暴发的背景下,SARS-CoV-2病毒特异性抗体的动态监测可用于流行病学调查和血清学诊断。但由于本研究的样本量较小,收集的数据有限,且研究的患者主要为普通型及轻型患者,缺乏危重型患者,可能对结果的判断产生选择性偏倚。因此,本研究对SARS-CoV-2抗体变化规律仅做初步分析,结论有一定的局限性,要获得更确定的结论还需进一步研究探讨。
利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突