动态监测COVID-19确诊患者SARS-CoV-2感染后体内特异性IgM和IgG抗体的变化特点，并分析其临床意义。
收集2020年1月8日至2月21日在河南省疾病预防控制中心核酸检测阳性的56例COVID-19确诊患者不同病程的168份血清样本，已排除COVID-19的25例健康人群的血清样本作为对照组，采用化学发光法检测SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体。
IgM抗体在发病后1～3周急剧上升，在发病后第3周达到峰值(21.78 AU/ml)；IgG抗体在发病后3～6周上升幅度最大，在发病后第9周达到峰值(81.58 AU/ml); IgM和IgG抗体水平与患者年龄和病程密切相关(P<0.05)。其中30～60岁组抗体水平最高，急性期、既往感染IgM抗体阳性率与抗体水平低于恢复期，急性期IgG抗体阳性率与抗体水平均低于恢复期和既往感染；在整个病程中，IgM和IgG抗体水平总体呈现急性期逐渐升高、恢复期达到高峰、既往感染下降并维持在一定水平的趋势。
血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体检测可作为COVID-19的辅助诊断指标，对其连续观测有助于流行病学调查、血清学诊断及病程监测。
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新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的新发急性呼吸道传染病，具有极强的传染性[1]。该病尚无特效治疗药物，早发现、早诊断是控制疫情的关键[2]。在国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》中，COVID-19确诊标准在原有核酸检测的基础之上增加了抗体检测[3]。机体感染SARS-CoV-2后可引起适应性体液免疫应答，通过检测感染者血液中特异性IgM、IgG抗体可间接判断机体是否携带病毒。其中IgM抗体一般在感染初期产生，提示近期感染，IgG抗体为病原体刺激效应细胞二次应答后产生的抗体，可提示感染进入恢复期或既往感染[4]。但以上只是一个普遍规律，SARS-CoV-2作为一种新出现的病毒，病程中特异性抗体应答规律尚不清楚。因此，本研究基于化学发光免疫分析技术，定量检测COVID-19患者血清样本中SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体，分析急性期、恢复期和既往感染患者体内抗体水平变化特点，为COVID-19的预防、诊断和流行病学调查提供参考依据。
收集2020年1月8日至2月21日在河南省疾病预防控制中心核酸检测阳性的56例COVID-19确诊患者不同病程(急性期、恢复期和既往感染)的168份血清样本，病例的最长观察期为207 d。此外，以河南省疾病预防控制中心排除COVID-19的25例健康人群的25份血清样本作为对照组。诊疗标准符合《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》[3]。所有入选人员均签署书面知情同意书。
所有研究对象均采集空腹静脉血5 ml，置于含分离胶的黄头真空采血管内，室温静置待血液凝固，1 500～2 000 r/min离心10 min，取血清备用。血清检测前应于56℃灭活30 min。24 h内检测的样本置于4℃冰箱中保存，24 h内不能及时检测的样本置于-20℃及以下冰箱中保存。操作者在严格防护下按《新型冠状病毒实验室生物安全指南(第二版)》进行实验操作[5]。
以COVID-19确诊患者开始出现临床症状(发热或咳嗽)计为发病。采集56例确诊患者3个病程的血清样本，包括急性期(发病后1～21 d，核酸检测为阳性)、恢复期(发病后28～63 d，核酸检测转阴)和既往感染(发病后175～210 d，核酸复查阴性)。对血清样本进行IgM和IgG抗体的连续监测，并进行动态变化分析。
新型冠状病毒特异性IgM和IgG抗体检测试剂盒购自安图生物股份有限公司，IgM抗体检测试剂盒货号为20200617、20201023、20201223, IgG抗体检测试剂盒货号为20200612、20200618、20201023；检测仪器为AutoLomo A2000 PLUS化学发光测定仪。
采用磁微粒化学发光法检测SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体，IgM采用捕获法原理进行检测，IgG采用间接法原理进行检测。磁珠包被的抗原成分均为SARS-CoV-2重组抗原。按试剂盒和仪器说明书进行操作，每次实验均同时检测阳性质控品和阴性质控品。阳性判断值(Cut off)＝阳性对照孔平均发光值×0.2。S/CO＝待测样本发光值/Cut off值，当S/CO≥1.00时，检测结果判为阳性；S/CO<1.00时，检测结果判为阴性。当抗体浓度处于临界状态时，对样本进行复测(重复性较好)，取均值分析。
采用SPSS22.0统计软件进行分析，根据资料是否呈正态分布，采用均值±标准差或P50 (P25，P75)描述，其中IgM和IgG抗体水平资料不呈正态分布(经对数转换后呈正态分布)。采用χ2检验进行抗体阳性率之间的差异比较；采用广义估计方程对IgM和IgG抗体水平变化作多因素分析，以排除重复测量对结果的影响。
56名COVID-19确诊患者中，男性26人，女性30人。轻症患者13人，普通患者42人，重症患者1人。患者年龄平均为47.54±11.56岁，<30岁有3人，30～60岁有40人，>60岁有13人。其中，26.79%患者有高血压、心血管疾病、肺部疾病等既往病史。在临床症状和体征中，83.93%以上患者起病有发热症状，30%以上患者有干咳、乏力和咳痰等症状。
IgM和IgG抗体阳性率如表1所示，发病后第1周，IgM和IgG抗体阳性率较低，分别为47.06%、88.24%。发病后第5周IgG抗体全部阳转，发病后第6周IgM抗体全部阳转。进一步分析患者在不同病程IgM和IgG抗体阳性率差异，IgM抗体在急性期阳性率为57.14%，之后逐渐转阳，在恢复期最高(94.64%)，既往感染呈转阴趋势(69.46%)。IgG抗体在急性期阳性率为85.71%，恢复期上升至100%，在既往感染中仅有1例抗体转阴，其他均为阳性，且抗体阳性率保持在较高水平(98.21%)。不同病程SARS-CoV-2 IgM抗体阳性率比较差异有统计学意义(χ2＝23.64，P<0.05), IgG抗体阳性率比较差异有统计学意义(χ2＝11.33，P<0.05)。其中，急性期、既往感染IgM抗体阳性率低于恢复期，急性期IgM抗体阳性率与既往感染相比差异无统计学意义；急性期IgG抗体阳性率低于恢复期和既往感染，恢复期IgG抗体阳性率与既往感染相比差异无统计学意义。
不同病程间IgM和IgG抗体阳性率及中位数比较
Comparison of positive rates and medians of IgM and IgG antibodies between different courses of disease
不同病程间IgM和IgG抗体阳性率及中位数比较
Comparison of positive rates and medians of IgM and IgG antibodies between different courses of disease
| 病程 | 标本采集距发病天数 | 标本数量(n) | IgM抗体 | IgG抗体 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 阳性率(%) | 抗体水平(AU/ml) | 阳性率(%) | 抗体水平(AU/ml) | ||||
| 急性期 | 第1周(1～7 d) | 34 | 47.06 | 0.75 | 88.24 | 2.16 | |
| 第2周(8～14 d) | 16 | 68.75 | 7.68 | 81.25 | 6.72 | ||
| 第3周(15～21 d) | 6 | 83.33 | 21.78 | 83.33 | 9.62 | ||
| 恢复期 | 第5周(28～35 d) | 8 | 87.50 | 5.60 | 100.00 | 51.44 | |
| 第6周(36～42 d) | 4 | 100.00 | 15.82 | 100.00 | 70.60 | ||
| 第7周(43～49 d) | 18 | 94.44 | 10.33 | 100.00 | 59.75 | ||
| 第8周(50～56 d) | 20 | 95.00 | 6.68 | 100.00 | 45.53 | ||
| 第9周(57～63 d) | 6 | 100.00 | 14.07 | 100.00 | 81.58 | ||
| 既往感染 | 第26周(175～182 d) | 4 | 50.00 | 1.54 | 100.00 | 5.17 | |
| 第27周(183～189 d) | 8 | 75.00 | 2.03 | 87.50 | 22.76 | ||
| 第28周(190～196 d) | 20 | 65.00 | 2.20 | 100.00 | 18.67 | ||
| 第29周(197～203 d) | 20 | 75.00 | 1.48 | 100.00 | 15.17 | ||
| 第30周(204～210 d) | 4 | 75.00 | 3.22 | 100.00 | 23.77 | ||
| 总计 | |||||||
| 急性期 | 第1～3周(1～21 d) | 56 | 57.14 | 2.01 | 85.71 | 2.48 | |
| 恢复期 | 第5～9周(28～63 d) | 56 | 94.64 | 7.40 | 100.00 | 59.16 | |
| 既往感染 | 第26～30周(175～210 d) | 56 | 69.64 | 1.66 | 98.21 | 16.99 | |
IgM和IgG抗体中位数如表1所示，发病后第1周，IgM和IgG抗体中位数最低，分别为1.46 AU/ml、2.16 AU/ml。IgM抗体在发病后1～3周急剧上升，在发病后第3周(急性期)达到峰值(21.78 AU/ml)；IgG抗体在发病后3～6周上升幅度最大，在发病后第9周(恢复期)达到峰值(81.58 AU/ml)。
发病后患者血清IgM和IgG抗体水平变化情况如图1所示，不同病程中，IgM抗体中位数分别为2.01 AU/ml、7.40 AU/ml、1.66 AU/ml，IgG抗体中位数分别为2.48 AU/ml、59.16 AU/ml、16.99 AU/ml。以患者性别、疾病分型、年龄、有无既往病史、病程为自变量，以病程为重复测量因素，并分别以IgM(对数转换)和IgG(对数转换)抗体水平为因变量，采用广义估计方程进行多因素分析。结果排除重复测量和混杂因素影响后，年龄组IgM和IgG抗体水平差异有统计学意义(Wald检验χ2＝27.64，P<0.05；Wald检验χ2＝15.41，P<0.05)，30～60岁组IgM和IgG抗体水平最高；不同病程组IgM和IgG抗体水平差异有统计学意义(Wald检验χ2＝131.9，P<0.05；Wald检验χ2＝195.52，P<0.05)，其中急性期、既往感染IgM抗体水平低于恢复期，急性期IgG抗体水平均低于恢复期和既往感染。
不同病程IgM和IgG抗体水平动态变化如图2、图3所示，在56例确诊患者中，IgM和IgG抗体水平总体呈现急性期逐渐升高、恢复期达到高峰、既往感染下降并维持在一定水平的趋势。其中，患者在既往感染IgM抗体逐渐下降至较低水平(1.66 AU/ml)，IgG抗体虽也降低，但维持在较高的水平(16.99 AU/ml)。
SARS-CoV-2抗体检测是一种新的检测方法，需要验证试剂的可靠性和明确特异性抗体产生的规律，使SARS-CoV-2抗体检测结果更科学和准确地应用于临床。本研究表明，急性期IgM和IgG抗体检测临床敏感度分别为57.14%(32/56)和85.71%(48/56)，健康人群血清样本IgM和IgG抗体均无假阳性，即特异度为100%。由此可见，相对于临床症状和SARS-CoV-2核酸检测，IgM和IgG抗体检测与临床诊断结果虽尚不能达成完全一致，但仍具有较好的临床特异度和敏感度，可以作为COVID-19筛查和诊断的辅助诊断指标。
IgM抗体在发病后1～3周急剧上升，在发病后第3周达到峰值(21.78 AU/ml)，IgG抗体在发病后3～6周上升幅度最大，发病后第9周达到峰值(81.58 AU/ml)，并在发病30周后仍具有较高的水平(16.99 AU/ml)，提示SARS-CoV-2特异性抗体的达峰时间较晚，这与徐云云等[6]、罗效梅等[7]和吴满辉等[8]研究一致。本研究与机体免疫应答规律相一致：IgM抗体先升高后降低，IgG抗体出现晚于IgM抗体，可存在较长时间，产生的IgG抗体是否具有保护性还需检测中和抗体进一步验证。
研究显示[4]，在恢复期、既往感染中，核酸检测阴性，IgM检测阴性、IgG检测阳性提示患者可能既往感染SARS-CoV-2，但已恢复或体内病毒被清除，免疫应答产生的IgG抗体维持时间长，仍存在于血液中而被检测到；核酸检测阴性，IgM检测阳性、IgG检测阳性，提示患者近期曾感染SARS-CoV-2并处于恢复期，体内病毒被清除，IgM尚未减低至检测下限；或核酸检测结果假阴性，患者处于感染活跃期。在本研究中，从确诊病例核酸转阴进入恢复期后，SARS-CoV-2 IgM抗体阳性率逐渐降低，至既往感染抗体阳性率为69.64%，而IgG仍然具有较高的阳性率(98.21%)，且在恢复期、既往感染IgM抗体阳性的患者，其IgG抗体也为阳性。这与感染病毒后人体出现IgM和IgG抗体的变化规律一致，随着治疗或病程的转归，IgM抗体浓度逐渐降低，而IgG抗体浓度会维持一段时间，表明患者已经产生相应的免疫力，并正向痊愈方向发展。
本研究发现，在整个病程中，COVID-19患者IgM抗体阳性率和抗体水平均低于IgG，IgM抗体全部阳转时间晚于IgG，李萍等[9]也有相同的研究结论。SARS的血清学诊断研究结果表明，在疾病的早期IgG抗体阳性率比IgM抗体阳性率高[10,11]。这与一般传染病的IgG类抗体出现规律不一致，分析其原因可能与以下因素有关：(1)结合流行病学调查和密切接触史，推测这些病例感染SARS-CoV-2的时间可能更早，IgM抗体阳性率要低于实际值，而IgG抗体阳性率可能要高于实际值；(2)此现象可能由SARS-CoV-2抗体动力学变化的特殊性所导致，需大样本的临床数据和可靠试剂来验证；(3)COVID-19是一种新型传染病，其血清学诊断方法亦处于初始阶段，检测结果可能存在一定的假阳性。因此，此结果有待于进一步研究。
相关研究显示[12,13]，COVID-19患者体内特异性抗体水平和患者的病情进展有着重要关系，且体液免疫应答强度与疾病严重程度成正比。但在本研究中，重型和普通型患者的IgM和IgG抗体与轻型患者相比差异没有统计学意义，与之前的研究不符，这可能与样本数较少有关。本研究中，COVID-19患者多为中老年人，且30～60岁组IgM和IgG抗体水平最高，性别间的IgM和IgG抗体水平没有显著性差异。分析原因可能为中老年人免疫器官功能衰退，免疫功能下降，更易发生感染，但中老年人往往具有较高比例的记忆性淋巴细胞，在病毒侵袭时，可迅速活化产生免疫性抗体，产生较高水平的特异性抗体。进一步分析不同病程患者IgM和IgG的抗体水平，结果显示IgM和IgG抗体水平在急性期呈上升趋势，在恢复期时最高，28名患者(50%)恢复期IgG抗体滴度较急性期有4倍及以上升高。IgM和IgG抗体水平在急性期逐渐升高、恢复期达到高峰、既往感染下降并维持在一定水平。
综上所述，在COVID-19全球范围暴发的背景下，SARS-CoV-2病毒特异性抗体的动态监测可用于流行病学调查和血清学诊断。但由于本研究的样本量较小，收集的数据有限，且研究的患者主要为普通型及轻型患者，缺乏危重型患者，可能对结果的判断产生选择性偏倚。因此，本研究对SARS-CoV-2抗体变化规律仅做初步分析，结论有一定的局限性，要获得更确定的结论还需进一步研究探讨。
所有作者均声明不存在利益冲突
