探讨HIV派生的MicroRNA99(miRNA99)对巨噬细胞焦亡的影响及机制。
用佛波酯(PMA)刺激人单核白血病细胞(THP-1)分化成贴壁的巨噬细胞，流式细胞术测定细胞表面CD11b；将鉴定好的细胞分组，分为PBS组(空白对照)、LPS＋ATP组(阳性对照)、miRNA99组(实验组)；将miRNA99 mimics转染至细胞，采用Western blot(WB)方法测定活化caspase-1蛋白水平；采用ELISA法测定细胞上清液IL-18、IL-1β的水平；将巨噬细胞细胞又分为2组，miRNA99＋TLR8 RNAi质粒组实验组、miRNA99＋空质粒组，转染细胞，在共聚焦下观察细胞内荧光；采用WB方法检测TLR8蛋白及活化caspase-1蛋白水平；用ELISA法测定TLR8沉默后细胞培养上清液中IL-18、IL-1β的水平。
经PMA刺激24 h后细胞贴壁生长，伸出伪足，表面CD11b阳性率在99%以上。LPS＋ATP组与miRNA99组活化caspase-1蛋白水平、上清液中IL-18、IL-1β的含量明显高于对照组(P<0.05)，差异有统计学意义。转染TLR8 RNAi质粒后巨噬细胞内呈现绿色荧光，WB显示实验组TLR8蛋白表达明显减少。在TLR8质粒＋miRNA99组，活化caspase-1蛋白水平及上清液中IL-18、IL-1β的含量明显低于空质粒＋miRNA99组(P<0.05)，差异有统计学意义。
HIV派生的miRNA99能诱导巨噬细胞发生焦亡，miRNA99诱导焦亡的机制有TLR8途径的参与。
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近期研究表明，慢性免疫激活是HIV感染持续进展的免疫病理机制[1]。研究发现，CD4＋T细胞焦亡是HIV感染后CD4＋T细胞减少及慢性免疫激活的重要原因[2,3]。细胞焦亡，是由caspase-1介导的促炎程序性细胞死亡方式，伴随着大量促炎因子IL-18、IL-1β的释放，诱发级联放大的炎症反应[4]。MicroRNA(miRNA)是全长为19～24个核苷酸片段的小型非编码RNA，主要通过RNA干扰使目的基因沉默从而调控细胞基因的表达[5]。TLR7、TLR8识别ssRNA，TLR3识别dsRNA[6]，研究发现HIV-1单链核糖核酸(ssRNA)与细胞表面的TLR8受体结合后，通过使细胞核染色质重组继而促进人巨噬细胞释放TNFα[7]。miRNA99是由HIV派生的一段富集GU的寡核苷酸序列，前期研究发现miRNA99能通过TLR8信号通路促进肺泡巨噬细胞释放TNFα、IL-1β，是HIV病毒导致机体慢性免疫激活的重要原因[8]。miRNA99能否诱导巨噬细胞发生焦亡及机制尚不明确。本试验通过转染miRNA99 mimics，观察巨噬细胞焦亡相关蛋白及炎症因子的释放，进一步研究HIV派生的miRNA99对巨噬细胞焦亡的影响。为进一步研究miRNA99的作用机制，本研究转染了TLR8 RNAi的质粒，观察阻断TLR8通路后细胞焦亡相关物质的表达水平。本研究初步探讨了HIV-1感染时导致机体慢性免疫激活的焦亡机制，旨在为HIV-1感染时免疫损伤的治疗提供新思路。
