探讨红景天苷对大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)缺血/再灌注损伤的影响及其可能的机制。
分离培养大鼠CMECs，建立模拟缺血/再灌注模型，分为对照组、模拟缺血/再灌注(SI/R)组、SI/R＋红景天苷组(1.0、2.5、5.0、10.0 μmol/L)组。待红景天苷最适浓度确认为5 μmol/L后，增加SI/R＋红景天苷＋LY[磷酯酰肌醇3激酶(PI3k)特异性抑制剂LY294002]组。MTT法检测细胞增殖能力，细胞划痕实验检测细胞迁移能力，TUNEL法检测细胞凋亡，采用Western blot检测Akt磷酸化水平，以及凋亡抑制蛋白生存素和Bcl-2的表达。
与对照组相比较，SI/R组CMECs增殖能力明显降低(0.410±0.011比0.200±0.014，P＝0.041)，凋亡率显著上升(4.15%±0.12%比26.05%±0.97%，P＝0.018)，而与SI/R组相比，SI/R＋红景天苷组(1.0、2.5、5.0、10.0 μmol/L)细胞增殖能力明显升高并呈剂量依赖性，细胞迁移率，而凋亡率则明显下降(均为P<0.05)，LY294002组凋亡指数与SI/R＋红景天苷组相比显著提高(22.03%±0.98 %比16.28%±1.40%，P＝0.029)。与SI/R组相比较，红景天苷可显著上调Akt的磷酸化，以及上调抗凋亡蛋白生存素和Bcl-2的表达(均为P<0.05)，而此作用可被LY294002显著抑制(均为P<0.05)。
红景天苷可显著抑制缺血/再灌注损伤诱导的CMECs凋亡，促进细胞存活，改善细胞功能，其作用机制可能与激活PI3K/Akt，以及上调凋亡抑制蛋白生存素和Bcl-2表达相关。
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我国急性冠状动脉综合征的发病率逐年增高，且出现年轻化的趋势。尽快恢复堵塞血管血流是治疗的关键，然而常常伴随缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury，I/RI)，会部分抵消由血管再通治疗带来的临床受益。研究表明，在心脏I/R时心肌微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cell，CMECs)也会受累，且I/RI诱导的CMECs凋亡要早于心肌细胞[1]，提示CMECs扮演着重要角色。
红景天苷是传统中药红景天的主要有效成分，以往研究表明其具有抗疲劳和抗辐射等多种药理作用[2]。进一步发现其对心脏等多个重要器官具有保护作用[3,4]，我们前期研究证实红景天苷可通过激活PI3k/Akt信号通路激活HIF-1ɑ，抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡[4]。然而，其对CMECs是否有保护作用其可能的机制仍不明确。本研究旨在探讨红景天苷对I/RI诱导的心肌微血管内皮细胞凋亡的抑制作用，并探讨其作用的可能机制。
红景天苷(纯度>99%)购自中国药品生物制品鉴定所。新生牛血清、DMEM低糖培养基购自Gibco公司。胶原酶Ⅰ、噻唑蓝(MTY)、5-溴-2'-脱氧尿苷(bromodeoxyuri·dine，BrdU)、LY294002、RNaseA均购自Sigma公司。Hoechst33258染料、BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所。蛋白酶K购自Merck。Akt、磷酸化Akt、生存素和Bcl-2抗体均购自CST。HRP、FITC标记羊抗兔二抗均购自北京中山。
按照本实验室建立的常规方法分离CMECs，免疫细胞化学染色进行细胞鉴定，具体步骤见参考文献[5]，实验所用细胞为稳定生长的第2～3代细胞。
模拟缺血/再灌注(simulated ischemia/reperfusion，SI/R)模型的建立见参考文献[6]。CMECs随机分组：(1)对照组：正常培养液培养，不加任何干预；(2)SI/R组；(3)SI/R＋红景天苷组(再灌注时分别给予不同浓度的红景天苷1.0、2.5、5.0和10.0 μmol/L，SI/R＋红景天苷)。比较各组CMECs细胞活性，确定最适浓度5 μmol/L后分组如下：(1)对照组；(2)SI/R组；(3)SI/R＋5 μmol/L红景天苷(SI/R＋红景天苷组)；(4)SI/R＋红景天苷＋LY组(LY294002，PI3k特异性抑制剂，20 μmol/L。
取同一批分离的CMECs，将细胞密度调整至1×105/ml接种于96孔板，每孔接种100 μl，每组设8个复孔待细胞生长至70%汇合后，按上述方法进行分组及造模复氧结束后加MTT 20 μl培养4 h，吸弃上清后，每孔加入150 μl DMSO震荡10 min待结晶物溶解，用酶标仪于波长490 nm处检测各组吸光度值。
取同一批分离的CMECs，细胞密度调整至1×105/ml接种于24孔板，孵育24 h后吸弃培养液，100 μl移液器滴头沿培养板底划痕，每孔任选3个视野拍照，记录划痕区的相对距离。按上述方法进行随机分组，模型建立后继续以含1%FBS的DMEM培养基培养72 h后，参照先前拍照方式，记录各组划痕后的相对距离，测定CMECs的迁移能力。
制备细胞爬片，建立模型后，按照TUNEL试剂盒说明书操作。荧光显微镜下观察并拍照TUNEL染色阳性为凋亡细胞，呈绿色荧光，DAPI对所有细胞核进行染色，呈蓝色荧光每张爬片随机选取10个视野进行计数，每个实验组计数80个视野，统计内皮细胞总数和凋亡细胞数，取其平均值AI＝TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%。
将细胞重悬至细胞裂解液中，低温离心取上清液备用100 ml/L聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂乳的TBST封闭缓冲液中，加入Akt(1∶1 000)或磷酸化Akt抗体(1∶1 000)、生存素抗体(1∶1 500)或Bcl-2抗体(1∶1 500)。4℃孵育过夜加入相应二抗，37℃孵育1 h后，经化学发光法曝光后观察结果，以β肌动蛋白作为内参，采用Bio-image(Bio-Rad)分析软件采集信号和灰度扫描。
计量资料用(
±s)表示。用SPSS 11.0统计软件进行数据统计，组间比较用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
CMECs分离培养第2天呈梭形或者多角形，培养至第5天呈铺路石样排列，单层贴壁生长(图1A)。免疫细胞化学染色进行细胞鉴定，CMECs吞噬红色荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白后，细胞质呈红色荧光，DAPI染色后细胞核呈蓝色荧光(图1)，提示分离培养的细胞为内皮细胞，且具有较高的纯度，实验所用细胞为稳定生长的第2～3代细胞。
A: CMECs呈铺路石样排列，单层贴壁生长(×100)；B: acLDL染色后胞浆呈红色荧光(×400)；C: DAPI染色后细胞核呈蓝色荧光(×400)；D: acLDL和DAPI双标(×400)
与对照组相比较，SI/R组的吸光度值明显下降(0.410±0.011比0.200±0.014，P＝0.041)。与SI/R相比较，SI/R＋红景天苷(5 μmol/L)组的吸光度值明显升高(0.350±0.010比0.200±0.014，P＝0.037)，SI/R组＋红景天苷组中吸光度随着红景天苷浓度的升高而增加，显示经红景天苷刺激后，SI/R组细胞增殖能力升高有浓度依赖性(图2)，而5 μmol/L与10 μmol/L红景天苷组比较差异无统计学意义(0.350±0.010比0.360±0.015，P＝0.976)，确定5 μmol/L红景天苷为最适浓度。
与对照组相比，aP<0.05；与红景天苷1.0 μmol/L和2.5 μmol/L组相比较，bP<0.05
见图3。
A，B，C：划痕后再灌注0 h细胞迁移情况；D，E，F：再灌注72 h后的细胞迁移情况与对照组相比较，再灌注72 h后，SI/R组几乎无细胞迁移，CMECs的迁移能力受到损伤，而与SI/R组相比较，SI/R＋红景天苷(5 μmol/L)组CMECs向损伤区的迁移能力增强
与对照组相比较，SI/R组的CMECs凋亡率明显增加(26.5%±0.97%比4.16%±0.22%，P＝0.018)与SI/R相比较，SI/R＋红景天苷(5 μmol/L)组CMECs凋亡率显著降低(15.78%±1.07%比26.5%±0.97%，P＝0.032)。而加入PI3k特异性抑制剂后与SI/R＋红景天苷相比，细胞凋亡则增加，且差异具有统计学意义(22.5%±0.87%比15.78%±1.07%，P＝0.029)(图4)。
TUNEL染色阳性为凋亡细胞，呈绿色荧光；DAPI对所有细胞核进行染色，呈蓝色荧光。与SI/R组相比，aP<0.05，与SI/R＋红景天苷组相比，bP<0.05
Western blot检测结果显示，与SI/R组相比较，红景天苷可显著上调Akt的磷酸化水平(P＝0.043)；而是用PI3K特异性抑制剂LY294002后，磷酸化Akt水平显著下降(P＝0.039)，见图5。进一步的研究提示红景天苷可显著上调抗凋亡蛋白生存素和Bcl-2表达水平。前期研究证实上调抗凋亡蛋白生存素可显著抑制I/RI诱导的心肌细胞和心肌微血管内皮细胞凋亡[7,8]，Western blot结果表明，与SI/R组比较红景天苷可显著上调生存素和Bcl-2水平(均为P<0.05)，而使用PI3K特异性抑制剂LY294002后，上调的生存素和Bcl-2明显被抑制(均为P<0.05，见图6)。
与SI/R组相比较，aP<0.05；与SI/R＋红景天苷组相比较，bP<0.05
与SI/R组相比较，aP<0.05；与SI/R＋红景天苷组相比较，bP<0.05
心肌缺血再灌注损伤临床较为常见，其机制复杂，目前尚未完全阐明[9]，以往研究多集中在心肌细胞和冠状动脉大血管的损伤和保护。然而近期的我们及其他实验室的研究表明CMECs在I/RI过程中也扮演重要角色[7,8]，与冠状动脉大血管内皮细胞相比，CMECs数量更多，并且在形态和功能上具有明显的组织特异性，此外，CMECs同时接触血液和组织细胞，接受来自两方的理化刺激，功能特性更加复杂。研究发现，I/RI在微血管水平的病理变化主要表现为CMECs正常屏障功能损伤和细胞凋亡[10]，在再灌注早期，CMECs凋亡的发生早于心肌细胞[1]，综上所述提示保护CMECs可能是早期减轻I/RI的关键。
红景天是常用的传统中药材，红景天苷是其主要的有效成分，除具有显著的抗疲劳、抗辐射、抗衰老和免疫调节等多种药理作用外，近期的研究显示对于脑和肾脏等重要脏器的缺血损伤具有显著的抑制作用[2,3,11]。我们前期研究发现，红景天苷可通过PI3K/Akt通路激活HIF-1α抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡，但红景天苷是否对于扮演重要角色的CMECs是否有保护作用，尚未见报道。本研究采用体外培养大鼠CMECs，建立模拟的I/RI模型，从细胞水平观察红景天苷是否能够保护CMECs，抑制I/RI诱导的心肌冠状动脉微血管内皮细胞凋亡，同时探讨其可能的分子机制。本研究表明，红景天苷可显著抑制模拟I/RI诱导的心肌细胞凋亡，并且MTT检测结果表明其保护作用呈剂量依赖型，而5与10 μmol/L对于改善细胞活性方面差异无统计学意义。与对照组相比较，5 μmol/L红景天苷可显著改善CMECs的迁移能力，并减少损伤诱导的CMECs凋亡。生存素[7]及Bcl-2是重要的凋亡相关分子，本研究进一步的Western blot结果提示，红景天苷可显著上调生存素和Bcl-2水平，其作用与激活PI3K/Akt信号通路相关。红景天苷在整体水平的保护作用，以及是否能激活其他重要凋亡相关分子如p53或caspase-3等，有待于进一步研究探讨。
