研究β葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞的形成和迁移能力的影响。
培养RAW264.7巨噬细胞，氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导其为泡沫细胞。油红O染色观察对照组、ox-LDL组和β葡聚糖干预组(β葡聚糖＋ox-LDL孵育)泡沫细胞的形成；实时定量PCR检测各组细胞炎症因子肿瘤坏死因子α和转化生长因子β及白细胞介素6和10、CC趋化因子受体1(CCR1)、CCR2、CCR5和CCR7的mRNA表达水平；流式细胞术检测细胞表面趋化因子受体的表达；Transwell™迁移实验检测细胞对CC趋化因子配体19 (CCL19)和CCL21的趋化能力。
ox-LDL处理后细胞被油红O染成暗红色，而β葡聚糖干预组中细胞染色变浅；与ox-LDL组比较，β葡聚糖可下调泡沫细胞肿瘤坏死因子α mRNA的表达，并上调CCR7的表达，明显促进泡沫细胞向CCL19/CCL21的趋化反应(均为P<0.05)。
β葡聚糖不仅抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成，还可通过促进泡沫细胞CCR7的高表达，增强其迁移能力。
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动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种常见的心血管疾病。AS的发病机制复杂，其中巨噬细胞吞噬氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)形成巨噬细胞源性泡沫细胞，是AS形成和发展的关键环节[1]。正常情况下，巨噬细胞包裹异物后会发生迁移，但巨噬细胞源性泡沫细胞在清除脂质后不离开病灶，且分泌更多的促炎因子，降解细胞外基质，诱发细胞凋亡，促进斑块的恶性演进及易损状态的形成。因此，促进泡沫细胞外迁出病灶，将会极大促进AS治疗策略的发展。而研究表明，巨噬细胞在脉管管壁的滞留性可被逆转[2]。
β葡聚糖是一种天然多糖，具有抗炎、降糖、降血脂的作用。Lim等[3]研究发现β葡聚糖可降低高脂饮食仓鼠血清内三酰甘油、总胆固醇及低密度脂蛋白，抑制腹主动脉和胸主动脉的粥样硬化。我们研究发现[4]，β葡聚糖可明显减弱ox-LDL诱导的丙二醇甲醚醋酸酯促分化的单核—巨噬细胞表面共刺激分子及炎症因子的表达，并抑制人AS斑块细胞的炎症细胞因子的产生。然而，β葡聚糖是否对泡沫细胞形成及迁移发挥作用，目前尚不明确。有研究发现，趋化因子受体7(chemokine receptor 7，CCR7)的表达在心血管疾病发生发展中存在差异性，提示CCR7可能参与其病理生理的过程[5]。本研究拟用ox-LDL诱导RAW264.7巨噬细胞为泡沫细胞的模型，并用β葡聚糖进行干预，通过观察泡沫细胞内脂质的聚集、炎症因子及趋化因子受体的表达和对CCL19/CCL21的趋化反应性，评估β葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞形成及迁移能力的影响，探讨β葡聚糖在AS发生发展中的作用及相关机制。
β葡聚糖由美国路易斯维尔大学严俊教授惠赠；ox-LDL(100 mg/ml)购自上海翊圣生物科技有限公司；RAW264.7巨噬细胞购自中国科学院上海细胞库；小鼠重组CC趋化因子配体19 [recombinant mouse chemokine(C-C motif)ligand 19，rmCCL19]和rmCCL21购自Biolegend公司；抗小鼠的CCR1和CCR7抗体分别购自R&D Systems公司和Cell Signaling Technology公司；油红O试剂购自美国Sigma公司；TRIzol试剂、逆转录试剂盒和SYBR Green Mix购自Vazyme公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、DMEM培养基、PBS购自Gibco公司；各目的基因的引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
复苏RAW264.7巨噬细胞，放于含有100 ml/L FBS的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，隔天换液。用含有EDTA的0.25%胰酶消化传代，细胞传至第5代后，将其接种到六孔板中并随机分为对照组、ox-LDL组(80 μg/ml ox-LDL孵育细胞)、β葡聚糖干预组(100 μg/ml β葡聚糖和80 μg/ml ox-LDL共同孵育细胞)。
以上三组细胞培养24 h后，小心吸弃培养液，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS轻柔洗2次；稀释油红储存液，油红∶去离子水＝3∶2，滤纸过滤，室温放置10 min；油红O染色20 min，吸弃染液，用60%异丙醇漂洗细胞5 s，除去多余染液，PBS轻柔洗3次后显微镜下拍照。
细胞孵育24 h后，收集细胞，采用TRIzol法提取细胞RNA，酶标仪检测其纯度和浓度，用逆转录试剂盒将其逆转为cDNA。随后在实时荧光定量PCR仪上进行目的片段扩增。PCR的反应总体系参照说明书，上下游引物各0.4 μl、2 × SYBR Green Supermix 10 μl、cDNA模板2 μl，总共20 μl。以GAPDH作为内参基因，每组样品设3个复孔，各目的基因的上下游引物序列见表1。PCR的反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，60℃退火30 s，总共进行40个循环；溶解曲线设定为60℃(10 s)、95℃(10 s)。mRNA的相对表达量计算公式为2－ΔΔct法。
实时定量PCR引物序列
实时定量PCR引物序列
| 引物 | 正向(5’～3’) | 反向(5’～3’) |
|---|---|---|
| TNF-α | TGTAGCCCACGTCGTAGCAAA | CTGGCACCACTAGTTGGTTGT |
| IL-10 | ACTGGCATGAGGATCAGCAG | CTCCTTGATTTCTGGGCCAT |
| IL-6 | GAGAAAGAGTTGTGCAATGGC | CCAGTTTGGTAGCATCCATCAT |
| TGF-β1 | TGCTAATGGTGGACCGCAA | CACTGCTTCCCGAATGTCTGA |
| CCR1 | AAGGCCCAGAAACAAAGTCT | TCTGTAGTTGTGGGGTAGGC |
| CCR2 | AGCACATGTGGTGAATCCAA | TGCCATCATAAAGGAGCCA |
| CCR5 | ATACCCGATCCACAGGAGAA | CCATTCCTACTCCCAAGCTG |
| CCR7 | TAAGGGCATCTTTGGCATCT | CAGTGAGCATCTCAGCGTGT |
| GAPDH | TGTGATGGGTGTGAACCACG | CAGTGAGCTTCCCGTTCACC |
将细胞用PBS洗涤后，分别加入适量的荧光团标记的抗体(CCR1-PE或者CCR7-APC)，4℃避光染色30 min，PBS洗涤2次后，并将细胞重悬于500 μl含有20 ml/L胎牛血清的PBS中，然后用FACSCantoⅡ流式细胞仪检测。
用24孔Transwell板(8 μm膜)检测细胞的迁移能力。将对照组、ox-LDL组和β葡聚糖干预组的细胞培养24 h后，收集细胞，并3组均将3×105个细胞分别种于Transwell板的上室中，添加含100 ml/L FBS DMEM培养基至200 μl；将CCR7的两种配体CCL19和CCL21(浓度为200 ng/ml)加入到下室中，添加DMEM培养基至600 μl。以上的三组细胞分别做2个复孔，其中一个复孔，37℃、50 ml/L CO2条件下孵育4 h后用镊子小心取出上室并吸干培养基，用棉签擦掉小室上层细胞，移到预先加入约600 μl 75%乙醇的孔中，室温固定30 min，再将小室拿出底面朝上晾干，伊红和美蓝染色后用流水轻轻冲掉多余染料，底面朝上晾干，显微镜观察拍照；另外一个复孔，细胞孵育12 h后，用血球计数板计数从上室迁移到下室中的细胞，台盼蓝染色，计数活细胞数。结果用细胞迁移指数(实验组趋化至下室的细胞数/对照组趋化至下室的细胞数)来表示。
用Graphpad Prism 6.0软件进行统计分析，两组间的均数比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
油红O染色检测发现极少数的对照组细胞被油红O染色，当用ox-LDL处理巨噬细胞后，细胞被染成暗红色，胞内脂质明显增多；与ox-LDL组比较，β葡聚糖干预组中细胞吞噬了β葡聚糖后，细胞变大，胞内脂质聚集减少，细胞质染色变浅，表明β葡聚糖可抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成，见图1。
A：对照组；B：ox-LDL组；C：β葡聚糖＋ox-LDL组
荧光定量PCR检测结果显示，与对照组相比，ox-LDL组中TNF-α、IL-6和IL-10的mRNA表达增多；而当同时加入β葡聚糖后，ox-LDL诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞中TNF-α的表达明显减少(P<0.05)，IL-6和IL-10的表达无明显差别，而TGF-β的表达几乎没有变化(图2A)；此外，与ox-LDL组相比，β葡聚糖干预组细胞中趋化因子受体CCR1、CCR2、CCR5和CCR7的mRNA均有所增多，其中CCR1和CCR7的表达差异最为明显(均为P<0.05)(图2B)。流式细胞术进一步检测发现，β葡聚糖干预组中细胞表面CCR7分子的表达水平明显高于ox-LDL组(P<0.05)，而CCR1分子的表达变化不明显(图2C)。
A：RT-PCR检测细胞因子的表达水平；B：RT-PCR检测趋化因子受体的表达水平；C：流式细胞术检测细胞表面趋化因子受体CCR1和CCR7的表达。与对照组比较，aP<0.05；与ox-LDL组比较，bP<0.05
β葡聚糖是广泛分布于自然界中的一种生物效应调节剂，可作为病原体相关分子模式被巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞所识别，介导生物学功能[6]。已有研究发现β葡聚糖可减少巨噬细胞内总胆固醇和胆固醇酯的聚集，抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成[7]。在本实验中，我们选用的β葡聚糖是由去除原酵母菌Saccharomyces cerevisiae细胞及细胞壁剩余部分等多种处理后仅剩下"空细胞"制备而成，并采用ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞为泡沫细胞模型。图1中显示，与对照组比较，ox-LDL组中大多数细胞被油红O染色，细胞内含有脂质颗粒，表明巨噬细胞源性泡沫细胞制备成功；而β葡聚糖组中细胞内的脂质颗粒减少，表明β葡聚糖可降低巨噬细胞对ox-LDL的摄取，抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成，此实验结果与以上研究结果相一致。
研究发现AS斑块中的M1型巨噬细胞可分泌大量炎症因子，导致血管局部的炎症反应长期存在，促进斑块恶化；而巨噬细胞吞噬ox-LDL形成泡沫细胞，也可产生大量的炎症因子，炎症又可氧化修饰LDL，为泡沫细胞形成提供有利的条件[8]。本实验发现β葡聚糖下调泡沫细胞中TNF-α的表达，提示β葡聚糖通过抑制泡沫细胞的形成进而抑制其炎症因子的分泌，延缓AS的进展。
CCR7属于趋化因子受体超家族中的一员，可受到其配体CCL19和CCL21的趋化吸引而介导树突状细胞定向性迁移，激活T细胞介导免疫反应[9]。近年来相关研究发现，CCR7在AS发生过程中发挥着重要的作用，如高表达CCR7的巨噬细胞可从晚期AS斑块内快速迁出，缩小了斑块面积[10]；此外降低血浆中非高密度脂蛋白或增加高密度脂蛋白水平可促进单核细胞来源的细胞从斑块内迁移至周围淋巴系统中，导致斑块逆转，其机制与CCR7介导巨噬细胞迁移有关[11]。我们研究发现，β葡聚糖处理树突状细胞后CCR7的mRNA表达明显上调[12]，所以在本实验中我们用β葡聚糖处理泡沫细胞，结果显示CCR7的基因和蛋白表达水平都明显增加，同时与ox-LDL处理组比较，β葡聚糖干预组的泡沫细胞表现出对CCL19/CCL21的趋化性也明显上升，表明β葡聚糖可增强泡沫细胞的迁移能力。
综上所述，β葡聚糖不但抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成，还可通过促进泡沫细胞趋化因子受体CCR7的高表达，增强泡沫细胞的迁移能力，这为AS的临床治疗提供新思路和实验依据。
利益冲突：无
