探讨白藜芦醇(RES)是否通过沉默信息调节因子1/核因子κB(SIRT-1/NF-κB)通路改善大鼠急性心肌梗死(AMI)后炎症反应。
30只成年SD大鼠随机分成3组：假手术组(Sham组)、AMI组和RES组；观察4周后，采用qRT-PCR和Western blot检测心脏梗死交界区组织白细胞介素(IL)-1β、IL-6及SIRT-1的mRNA含量及蛋白质表达情况。Western blot检测心脏梗死交界区组织IKK、p-IKK、p65及p-p65蛋白质表达情况。
与Sham组相比，AMI组的IL-1β、IL-6在mRNA及蛋白水平表达显著升高(均为P<0.01)，p-IKK/IKK和p-p65/p65比值明显升高(均为P<0.001)，SIRT-1在mRNA及蛋白水平表达显著降低(均为P<0.001); RES组IL-1β、IL-6在mRNA及蛋白水平表达显著降低(均为P<0.01)，p-IKK/IKK和p-p65/p65比值均显著减低(均为P<0.01)，SIRT-1 mRNA及蛋白表达水平显著升高(均为P<0.001)。
RES可通过SIRT-1/NF-κB通路改善大鼠AMI后炎症反应，其作用机制可能与RES激动SIRT-1表达、抑制IKK及p-65磷酸化、阻止NF-κB信号通路的启动有关。
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急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是常见的心血管疾病，发病率高、致死率高，且死亡率总体呈现上升趋势[1]，而院内病死率无显著降低。我们前期研究显示，核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信号通路参与AMI的发生发展，而白藜芦醇(resveratrol，RES)通过抑制NF-κB信号通路表达起到心脏保护作用[2]，但具体机制未知。RES是一种强效的沉默信息调节因子(silent information regulator，SIRT)1激动剂，通过激动SIRT-1来发挥作用。因此，本研究拟采用SD大鼠制作AMI模型，并采用RES干预，以观察RES对AMI后SIRT-1/NF-κB信号通路及炎症反应的影响。
30只清洁级雄性SD大鼠(6月龄)，体重180～220 g，购自广东医学院实验动物中心，依据随机数字将实验SD大鼠分成3组：假手术组(Sham组)、AMI组和RES组(RES，10 mg·kg-1·d-1，腹腔注射)。通过结扎冠状动脉前降支制作AMI模型。所有SD大鼠按50 mg/kg戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉，并行面罩通气支持呼吸；AMI和RES组通过左侧第3或第4肋间隙开胸暴露心脏，打开心包，用6-0丝线结扎大鼠左冠状动脉前降支，通过心电图ST-T改变证实心肌缺血或者梗死；而Sham组只穿线不结扎，术闭后逐层缝合关胸；术后第1天RES组即给予腹腔注射RES(10 mg·kg-1·d-1)，Sham组和AMI组给予同等体积生理盐水。观察4周后，处死各组大鼠，获取其心脏组织。
每组取3只大鼠心脏组织，制作石蜡切片(厚度5 μm)，脱蜡后苏木精染色10 min，用自来水洗涤，直至不再有红色液体流下，用1%的盐酸乙醇溶液分化1 min，自来水洗涤1 min，再用伊红染色约3 min，自来水洗涤1 min，将组织切片逐级脱水后，二甲苯透明，中性树胶封片，置于显微镜下观察RES对大鼠心脏组织病理学变化的影响。
取约50 mg心肌组织，加入1 ml的Trizol试剂(Invitrogen公司，美国)，按照说明书操作步骤提取组织总RNA，分光光度计法测定总RNA的纯度及质量，以光密度在1.8～2.1视为合格，然后按照反转录试剂盒(宝生物工程大连有限公司)说明书将所提取总RNA进行反转录，再按照实时荧光定量PCR试剂盒(宝生物工程大连有限公司)说明书对相关基因进行荧光定量。大鼠IL-1β、IL-6及SIRT-1以及内参β-actin的PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计和合成(表1)。结果分析采用2-ΔCt相对定量分析方法：ΔCt(实验组)＝Ct(实验组目标基因)－Ct(实验组内参基因)；ΔCt(对照组)＝Ct(对照组目标基因)－Ct(对照组内参)。
基因PCR引物
基因PCR引物
| 基因 | 引物序列 |
|---|---|
| β-actin-qF | CCCATCTATGAGGGTTACGC |
| β-actin-qR | TTTAATGTCACGCACGATTC |
| IL-1β-qF | CAGTGAGGAGAATGACCTG |
| IL-1β-qR | GCTCTTGTCGAGATGCTGC |
| IL-6-qF | CTGCCTTCCCTACTTCACAAG |
| IL-6-qR | CATCATCGCTGTTCATACAATC |
| SIRT1-qF | CCTTCTACACATCACACTGTGTC |
| SIRT1-qR | CTTTACCACATTCTGACACTTCTC |
采用RIPA裂解液(碧云天生物公司)提取心肌组织总蛋白质，进行电泳后转印到聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂奶粉TBST溶液封闭1 h后，加入大鼠单克隆β-actin (1∶1 000，Abcam公司)、IL-1β一抗(1∶500，Abcam公司)、IL-6一抗(1∶500，Abcam公司)、SIRT-1一抗(1∶500 ，Abcam公司)、IKK一抗(1∶500，Abcam公司)、p-IKK一抗(1∶500，Abcam公司)、p56一抗(1∶500，Abcam公司)、p-p56一抗(1∶500，Abcam公司)后4℃过夜；第二天复温1 h后，二抗孵育2 h; ECL显影，暗房曝光。以目的条带与内参β-actin条带灰度值比值评定蛋白表达水平。
采用GraphPad Prism 5(GraphPad Software Inc，美国)进行数据分析，正态分布的计量资料用
±s表示，组间比较用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
HE染色结果显示，Sham组心肌细胞结构分明，心肌细胞排列整齐，细胞形态未见明显异常；AMI组大鼠心肌细胞排列紊乱，且细胞着色不均，心肌纤维肿胀、断裂；与AMI组相比，RES组心肌细胞和肌纤维排列相对整齐(图2)。
qRT-PCR检测发现，与Sham组相比，AMI组的IL-1β、IL-6在mRNA表达显著升高(均为P<0.01)，SIRT-1 mRNA表达显著降低(均为P<0.001)；较AMI组相比，RES组的IL-1β、IL-6在mRNA表达均显著降低(均为P<0.01)，SIRT-1 mRNA表达显著升高(P<0.001)，但RES组和Sham组的IL-1β、IL-6、SIRT-1 mRNA表达比较无明显差异(均为P>0.05)(图3)。
(ns：P>0.05；aP<0.01；bP<0.001)
Western blot检测发现，与Sham组相比，AMI组IL-1β、IL-6在蛋白水平显著升高(均为P<0.01)，SIRT-1蛋白水平表达显著降低(P<0.001)；与AMI组相比，RES组IL-1β、IL-6蛋白水平均显著减少(P<0.01)，而与Sham组相比没有差异(均为P>0.05)，SIRT-1蛋白水平显著升高(P<0.001)，但仍显著低于Sham组(P<0.01)。与Sham组和RES组相比，AMI组的p-IKK/IKK和p-p56/p56比值显著升高(P<0.01)；但RES组和Sham组的p-IKK/IKK和p-p56/p56比值无明显差异(均为P>0.05)(图4)。
研究发现，氧化应激[3]和炎症反应[4]参与AMI后心肌重构。IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α和单核细胞趋化蛋白1是慢性炎症主要参与者，均参与NF-κB信号路径调节[5,6]。P65是NF-κB的重要亚基，磷酸化后导致NF-κB二聚体从IκB α/p50/p65复合物中解离，活化移至细胞核，与核内多种基因的启动子结合，诱导靶基因的表达。前期研究结果提示，AMI后NF-κB信号通路会激活，NF-κB、IκBα、IKKα在基因和蛋白水平的表达均升高，而RES有改善NF-κB信号通路高表达的作用。
研究发现，SIRT-1是参与调节细胞氧化应激及炎症反应的关键酶，能明显减轻炎症反应和氧化应激作用[7]。RES具有抗氧化应激、抗炎症反应和抑制凋亡等作用[8]。本实验发现，心肌梗死区的炎症因子IL-1β、IL-6 mRNA及蛋白水平表达显著升高，p-p65/p65与p-IKK/IKK比值显著升高；而RES可降低IL-1β、IL-6 mRNA及蛋白水平及p-IKK/IKK和p-p65/p65比值；进一步证实RES可改善心肌梗死后炎症反应，通过抑制NF-κB激酶IKK磷酸化、抑制NF-κB的活性，达到抗氧化、保护心肌的作用。研究显示，RES是最强的SIRT-1的激动剂之一[9]。最近文献报道，其通过激活肝AMP激活的蛋白激酶和SIRT-1表达，增加肝脏和肌肉线粒体生物合成及抑制NF-κB的活性，改善能量代谢[10]。SITR-1通过增强IKK磷酸化促进IκBα降解，抑制NF-κB活性[11]。另外，SITR-1通过诱导NF-ΚB p65的磷酸化或者乙酰化来发挥生物学效应[12]。本实验发现，AMI后SIRT-1 mRNA及蛋白表达显著降低，p-p65/p65与p-IKK/IKK比值显著升高；RES却能显著提高SIRT-1 mRNA及蛋白水平表达，降低p-IKK/IKK和p-p65/p65比值。因此，我们推测RES保护心肌的机制可能与激动SIRT-1活性、抑制IKK及p65酸化激化、最终阻止NF-κB信号通路的启动有关。
综上所述，SIRT-1/NF-κB信号通路参与RES对大鼠AMI后炎症反应调节来保护心肌，其可能与SIRT-1激活IKK/NF-κB磷酸化有关，为我们下一步应用siRNA干扰技术体外细胞培养、验证RES通过SIRT-1/NF-κB通路改善大鼠AMI后炎症反应提供理论依据。
利益冲突：无
