本文报告了1例无创产前筛查（non-invasive prenatal screening, NIPS）假阴性的18-三体综合征病例。孕妇孕13周+4超声检查示胎儿颈项透明层3.2 mm，NIPS结果为阴性，孕22周超声检查发现胎儿多发畸形，孕22周+2再次行NIPS，结果依然为阴性。孕22周+3终止妊娠。采用基于高通量测序技术的基因组拷贝数变异测序和荧光原位杂交检测引产后胎儿及附属物标本，结果显示胎儿组织（皮肤、肝脏）染色体结果为47,XY,+18；脐带根部、脐带中部染色体为47,XY,+18；胎盘胎儿面中心和近中心，以及胎盘母体面中心和近中心处均未检测到染色体异常；胎盘胎儿面边缘及母体面边缘检测结果分别为Chr18:47,XY,+18[60]/46,XY[40]和Chr18:47,XY,+18[35]/46,XY[65]。胎盘嵌合是导致本例NIPS假阴性的原因。提示，NIPS前、后的遗传咨询尤为重要；对于NIPS阴性者，后续的超声随访非常重要；胎儿出现与染色体异常关系密切的超声征象建议行有创产前诊断。
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孕妇26岁，第1次妊娠。孕13周+4超声检查发现胎儿颈项透明层3.2 mm，孕妇自愿选择无创产前筛查（non-invasive prenatal screening, NIPS），结果为阴性。孕22周超声筛查显示胎儿多发畸形：颈后皮肤增厚并颈部淋巴管瘤、右肺发育不良、巨输尿管、巨膀胱、室间隔缺损、右肺动脉内径小、主动脉缩窄、胃泡不显示、羊水少、单脐动脉，提示可能存在染色体异常。孕妇及家属考虑终止妊娠。终止妊娠前（孕22周+2）抽取孕妇外周血再次行NIPS以排除非技术因素导致的NIPS假阴性。孕13周+4和孕22周+2孕妇外周血游离胎儿DNA（cell-free fetal DNA, cffDNA）浓度分别为7.9%和13.2%，标本质控均合格，高通量测序21-三体检测Z值分别为1.28和－0.98，18-三体检测Z值分别为－0.28和1.37，13-三体检测Z值分别为0.39和0.95，均为阴性（Z值正常参考范围为－3~3）。
孕22周+3引产终止妊娠。引产胎儿外观呈18-三体综合征表现：耳低位、小下颌、颈短、食指重叠在第三指上、小指重叠在第四指上（图1）。留取胎儿组织、胎盘及脐带，分别取胎盘的胎儿面中心、近中心、边缘，胎盘母体面中心、近中心、边缘组织各3块（4点、8点和12点方向）及脐带组织（图2和图3），大小均匀2 cm×2 cm。采用基于高通量测序技术的基因组拷贝数变异测序和荧光原位杂交技术行染色体拷贝数变异检测。结果显示，胎儿皮肤、肝脏组织染色体检查结果为47,XY,+18；胎盘胎儿面中心和近中心，以及胎盘母体面中心和近中心处均未检测到染色体异常；脐带根部和脐带中部为47,XY,+18；胎盘胎儿面边缘及母体面边缘检测结果分别为Chr18:47,XY,+18[60]/46,XY[40]和Chr18:47,XY,+18[35]/46,XY[65]。
注：1：脐带根部；2：中心；3：近中心；4：边缘；5：脐带中部
NIPS是通过对母体外周血中的cffDNA进行高通量测序检测胎儿染色体数目异常的产前筛查技术，对胎儿非整倍体染色体异常（21、18、13-三体）的检出率达到99%以上，假阳性率为0.1%~0.2%[1]。自2010年NIPS在临床应用以来，已证实其是一项安全、高效的产前筛查技术[2]，是胎儿染色体非整倍体筛查较为理想的技术手段[3,4,5]。母血中cffDNA是来自于胎盘而非来自于胎儿本身，由于胎盘嵌合体是一个相对常见的生物学现象（发生率为1%~2%），NIPS必定会出现假阳性和假阴性结果，因此其只能作为一项筛查技术。美国妇产科医师学会和美国母胎医学会共同发布指南，认为NIPS结果阴性的病例并不能完全排除胎儿异常的可能，而阳性病例后续需接受羊膜腔穿刺染色体分析[6]。在临床实践过程中，NIPS假阳性和假阴性病例不断被发现，NIPS假阳性多证实与局限性胎盘嵌合（confined placental mosaicism, CPM）有关[7,8,9,10,11,12]，而关于NIPS假阴性病例，相关报道较少[9,10,13,14,15]。本研究对1例CPM导致的NIPS假阴性病例进行回顾性分析，并通过文献复习探讨NIPS假阴性病例的特点及原因，以期为临床实践提供一定参考。
（1）母血中cffDNA浓度过低：是NIPS假阴性的主要原因之一。胎儿cffDNA在母体循环中必须达到4%以上[16]，低浓度的cffDNA会导致假阴性结果[17]。影响cffDNA浓度的因素包括孕周过小、母体肥胖、妊娠相关合并症/并发症、标本运输及储存不当等[18,19,20,21,22]。（2）胎盘嵌合：是导致NIPS出现假阴性结果的不可抗因素[10]，亦是主要因素[9]。胎盘嵌合分为CPM和真性胎儿嵌合（true fetal mosaicism, TFM）。CPM Ⅰ型和TFM Ⅳ型，染色体异常只存在于细胞滋养细胞，因此仅在绒毛短期培养后能见到；CPM Ⅱ型和TFMⅤ型，染色体异常局限于绒毛的间质核心，只有经过绒毛长期培养后方可见到；CPM Ⅲ型和TFM Ⅵ型，染色体异常既存在于细胞滋养细胞，也存在于间质核心，绒毛短期培养和长期培养后均可见到。CPM是NIPS假阳性的主要原因[9]，而TFM Ⅴ型是NIPS假阴性的主要原因[10]，CPM占胎盘嵌合的87%[23]。因此，NIPS假阳性的发生率明显高于假阴性的发生率。
本例孕妇在孕早期超声检查发现胎儿颈项透明层增厚，但孕妇选择NIPS，孕妇外周血cffDNA浓度2次检测均在4%以上，符合检测标准，排除因cffDNA浓度低导致的NIPS假阴性。颈项透明层增厚并非NIPS的适用人群，行侵入性产前诊断应是最佳选择，如果本例孕妇孕早期行绒毛取样术（chronic villus sampling, CVS）染色体检测，仅进行绒毛短期培养，染色体结果正常的可能性也非常大，因此阴性的结果也不能完全排除胎儿染色体异常可能。即便存在嵌合风险，也应选择CVS，以便尽早诊断。如果NIPS高风险的孕妇选择CVS作为产前诊断手段，需要同时分析细胞滋养细胞和间质核心，以获得胎儿是否受累的最准确的风险评估。本例孕妇孕22周超声筛查发现胎儿多发畸形且与18-三体综合征相关，引产后胎儿组织染色体检查证实为18-三体综合征。18-三体综合征的胎儿几乎100%出现多发畸形，超声检查诊断率较高，对于NIPS结果阴性的孕妇，后续的超声随访非常重要，必要时中孕期须进一步行羊膜腔穿刺或脐静脉穿刺进行有创产前诊断。本病例引产后取胎盘不同部位的组织进行检测，结果显示在胎盘胎儿面中心和近中心，以及胎盘母体面中心和近中心处均未检测到染色体异常；胎盘胎儿面边缘及母体面边缘检测到18-三体嵌合，嵌合比例分别为60%和35%。胎盘嵌合以及嵌合程度会中和异常核型cffDNA释放到母血中的实际数量，使得异常核型cffDNA含量低于NIPS可检测范围，本例仅在胎盘边缘检测到部分18-三体核型，导致释放至母体外周血中的18-三体的cffDNA的比例非常低，是本例NIPS产生假阴性的原因。
在临床实践中，NIPS假阴性率报道差异巨大，从1/16 000[24]或1/9 000[25]到1/200[26]，因此实际NIPS假阴性率目前尚不清楚。在一项基于52 673例孕妇的回顾性研究中，与21、18、13号染色体相关的CPM和TFM的发生率为0.17%，NIPS假阴性率为0.03%，TFM Ⅴ型是导致NIPS假阴性的原因[10]。胎盘嵌合总体发生率为1%~2%[23]，但由于胎盘嵌合导致NIPS检测结果出现假阳性或假阴性的发生率远低于胎盘嵌合的发生率，提示大多数的染色体胎盘嵌合没有被NIPS检测到。一项研究对6 000例高危患者的绒毛样本进行回顾性分析，发现由于胎盘嵌合的存在可能导致NIPS对13、18、21-三体胎儿检测的假阴性率为0.23%（14/5 967）[14]。另一项研究分析了24例NIPS假阴性病例，13例可用生物/技术原因解释，主要原因是TFM Ⅴ型[9]。关于NIPS假阴性病例多为个案报告，国内报告较少，且大部分病例并未给出明确的解释，已证实的NIPS假阴性病例发生的原因均为胎盘嵌合[13,15,27,28,29,30,31,32]。也有一些NIPS假阴性结果不能用cffDNA浓度低、胎盘嵌合等原因解释[33]，提示NIPS可能有更为复杂的生物机制和技术因素存在。因此，鉴于目前对于NIPS假阴性结果的原因并不十分清楚，更应该严格把握NIPS的临床适应证和禁忌证，做好NIPS过程中的质控，尽量降低因技术因素导致的NIPS假阴性的发生率。
通过对本例NIPS假阴性病例的分析和文献复习，提示：（1）NIPS当前只作为筛查技术，异常结果必须通过细胞遗传学诊断确诊；（2）NIPS前、后持续的遗传咨询非常重要；（3）重视NIPS后的超声随访，超声发现与染色体异常相关的征象，建议行侵入性产前诊断进一步确诊。目前基于孕妇外周血中cffDNA的NIPS技术存在一定的局限性，研究开发准确性更高的NIPS方法，如利用孕妇外周血中的胎儿有核红细胞及孕早期宫颈脱落滋养层细胞等，以实现真正的无创产前诊断。
