评价荧光染料SYTO13在高分辨熔解曲线技术(HRM)检测单核苷酸多态性(SNP)位点的基因分型能力和临床适用性。
实验性能验证。选择经测序确认rs3125734 C>T(Ⅰ类SNP )、rs255758 A>C(Ⅱ类SNP)和rs688C>T三个位点基因型的样本36例，以商业化HRM染料LCGreen Plus为对照，进行SYTO13对Ⅰ类和Ⅱ类SNP以及rs688C>T位点的长片段扩增(107 bp)与短片段扩增(52 bp)基因分型能力的评价。基因分型能力以野生型与纯合突变型的Tm差值ΔTm表示，独立样本t检验比较野生型和纯合突变型的Tm均值，两种染料之间检测能力的比较分析采用配对t检验。临床适用性以随机选取已测序分型的35例样本进行批量均相检测来评价。
SYTO13能够清楚直观地对Ⅰ类和Ⅱ类SNP进行基因分型(ΔTmclassⅠ＝0.36±0.05，tclassⅠ＝14.827，PclassⅠ＝0.000；ΔTmclassⅡ＝0.42±0.110，tclassⅡ＝9.539，PclassⅡ＝0.000)。均相检测时SYTO13对Ⅰ类SNP的基因分型直观性更好(ΔTmSYTO13＝0.39±0.027)，而对短片段扩增产物基因分型效果不佳。临床适用性评价结果显示SYTO13对长片段扩增的Ⅰ类和Ⅱ类SNP除个别离群样本外均能准确基因分型，离群样本经复查后也能准确分型。
SYTO13可作为HRM染料准确地对长片段扩增的Ⅰ类和Ⅱ类SNP位点进行基因分型，适合于临床常规应用。(中华检验医学杂志，2017, 40：88－94)
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HRM技术是基于嵌入饱和荧光染料的双链DNA在高温变性时产生特征熔解曲线进行基因突变扫描和基因分型的一种新方法，由于其高效、特异、操作简便、快速、成本低和均相检测的特点而被广泛应用。HRM技术实施DNA序列分析检测的两个基本条件是高分辨温度检测的PCR仪器和饱和荧光染料。目前已报道常用的HRM染料有LCGreen Plus、EvaGreen、Resolight和SYTO9，这些染料相对价格较贵，因此，寻找相对价格低廉的HRM荧光染料有利于HRM技术的推广和普及。SYTO13与SYTO9同属花青素核酸荧光染料家族，但价格不足SYTO9的一半，2007年Gudnason等首先报道了SYTO13在抑制PCR反应、改变DNA熔解温度和优先结合GC片段三个方面优于SYBR Green，可用于实时荧光定量PCR。2011年Eischeid进一步发现SYTO13的荧光信号强度和PCR扩增效率优于SYBR Green，并与商品化荧光染料EvaGreen进行比较，发现两者相当。2015年Radvanszky等再次验证SYTO13可用于real－time PCR，并进行了小片段单碱基突变基因(GJB2基因G>A，52 bp)、较大序列变异(DMPK基因Alu插入/缺失多态性，493 bp/381 bp)、无标记探针的HRM基因分型与突变扫描，得出SYTO13虽不及商品化HRM荧光染料LCGreen Plus和EvaGreen但也可用于HRM检测。尽管该文献探索了SYTO13可否用于HRM检测，但对其HRM检测性能和应用特点未作评价。本研究对SYTO13基因分型Ⅰ类SNP(C/T或G/A)和Ⅱ类SNP(C/A或G/T)以及长片段PCR产物与短片段PCR产物的检测能力和临床适用性进行评价，并总结归纳其应用要点。
