目前，各医院的核酸检测平台均超负荷运转，2019-nCoV核酸检测试剂盒的质量值得关注。由于疫情紧张，很多厂家的试剂一经研发出来就投入市场，没有做足够的性能验证试验，的确存在参差不齐的情况。本实验室在2019-nCoV核酸实验开展前曾拿A厂家的试剂和B厂家的试剂做过比对实验，比对的结果见表1。共255份标本（发热门诊疑似患者），A试剂检测出161份阳性/疑似的结果，94份阴性结果，B试剂检测出103份阳性/疑似的结果，152份阴性结果，两试剂的符合率仅有77.25%。现阶段在没有金标准作为对照的情况下，只能通过不断地比对不同试剂盒，才能找到相对满意的一款核酸检测试剂，尽量避免出现假阳性或假阴性。

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表1

新型冠状病毒核酸检测比对结果（份）

表1

新型冠状病毒核酸检测比对结果（份）

试剂	阳性+疑似	阴性
A试剂	161	94
B试剂	103	152

在一次下机分析结果时，本实验室发现连续49份标本仅有2份阳性，其余的47份阴性标本内标都没有扩增，这一异常的现象引起了全体核酸检测工作人员的警觉，在暂停发出报告的同时，开始逐一排查原因。首先，可能是实验操作失误导致整批标本出现假阴性，但复查后阴性结果的内标和靶基因仍然没有扩增，这说明并不是实验中的原因。然后，梳理实验前的每一个环节，标本运送时间、保存条件、采样人员以及受检者群体等等，最终发现是采样管的问题。外送单位在没有经过允许的情况下，私自更换采样容器，虽然从外观上看似规格一样，但里面的保存液成分却大不相同，由于2019-nCoV是单链RNA病毒，容易死亡和降解，所以对保存条件和环境有较高的要求，如果采样管里没有保存液或保存液成分不当都会造成假阴性的结果。目前，由于采样管供不应求，一个厂家断货通常只能换用另一个厂家的采样管来临时填补，各厂家生产采样管保存液成分及保存条件并不一致，从而造成了结果的不稳定，这是十分重要但又容易被忽视的一点。

病例1，女，65岁，因发热、乏力，2019-nCoV核酸检测阳性收入我院感染科治疗，2020年2月5日上午和下午分别送来两份咽拭子标本进行核酸检测。上午结果显示，两个探针（ORF1ab基因和N基因）只有一个探针在循环阈值（cycle threshold，Ct）> 43循环时微微抬起，这种1个位点的Ct值位于阳性Ct值和阴性Ct值之间的情况（本实验室使用的试剂盒阳性Ct值≤40），按照《新型冠状病毒肺炎病毒核酸检测专家共识》应判读为"可疑"结果^[4]，但临床检验人员对这种扩增不明显的曲线很容易当做阴性结果报出。下午结果显示，两个探针Ct值均< 39循环（Ct值≤40），毫无疑问地证明该病例是阳性结果。最终，本实验室对该患者上午的标本按"可疑"报出，下午的标本按"阳性"报出。由于本院使用的采样管含有RNA保护液，所以可以排除RNA降解的原因。另外，同一个患者同一天采集，病情也不可能有很大的变化。所以，分析造成这一结果最有可能的原因就是标本取材的问题。由于2019-nCoV核酸检测需要取咽拭子/鼻拭子，而咽拭子/鼻拭子取材临床平时很少开展，所以采样人员基本都是临时学习，如果培训不到位势必造成操作不统一，这就导致了核酸检测结果的不一致性。正确的咽拭子采集要同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，而鼻拭子采集要轻轻插入鼻道内鼻腭处停留片刻后缓慢转动退出，详细采样步骤及采样人员生物安全防护参见《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第二版）》，《新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）》^[5,6,7]。

病例2，男，31岁，因发热（39 ℃）、乏力、胸闷，CT提示病毒性肺炎（可能）入院，患者2020年1月以来连续进行了5次2019-nCoV核酸检测，仅有1次为阳性，其余均为阴性。后经查阅病史，该患者是一位人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency viruses，HIV）携带者，有着8年的抗病毒治疗史（治疗方案：齐多夫定+拉米夫定+奈韦拉平），入院后按抗病毒、抗感染治疗。经过分析，该患者长期服用抗HIV的药物是其2019-nCoV核酸检测反复阴性的主要原因。最近的研究也发现，抗HIV病毒的药物同样表现出抑制2019-nCoV的疗效。Li等^[8]通过软件高通量筛选预测出抗HIV病毒药物能够与2019-nCoV主蛋白酶构象结合，具有潜在的抑制作用。Xu等^[9]通过同源建模、分子对接等算法，分析出抗HIV药物（奈非那韦）能够有效抑制2019-nCoV。Beck等^[10]通过深度学习模型分析出抗HIV药物（阿扎那韦）是最好的抑制2019-nCoV化合物。此外，最新的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》也将抗HIV药物（洛匹那韦和利托那韦）写入了治疗用药指南中^[11]。最近的一篇综述则指出一种广谱病毒RNA聚合酶抑制剂（瑞德西韦）或许能成为最有效的2019-nCoV治疗药物^[12]，其临床药物试验正在武汉各家医院开展。可见在越来越多的抗病毒药物的使用下，人体内2019-nCoV的载量可能会因药物作用低于检测下限，其核酸检测的结果必然会有反复。

病例3，女，50岁，曾去过武汉市"华南海鲜市场"附近医院看病，体温37 ℃，因乏力、呼吸困难伴意识模糊入我院重症监护室，CT提示病毒性肺炎，临床高度怀疑2019-nCoV感染，但连续2次2019-nCoV核酸检测均为阴性。这种咽拭子反复检测都是阴性，而临床症状不断加重的情况，是最让医生和公众质疑的，以至于有专家提出应将CT检查取代核酸检测作为2019-nCoV的诊断标准。对于这种案例，《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》中的诊断标准也做了相应修改，在湖北地区，临床医生可以直接将具有肺炎影像学特征的疑似病例纳入临床诊断病例，而临床诊断病例的临床管理等同于确诊病例。虽然该病例根据影像学结果被纳入了临床诊断病例，但感染的病原体仍然无法被确诊，分析其中的原因主要是由于病毒感染部位造成的。呼吸道病毒感染的早期，病毒通常在鼻咽部高表达，到病程中后期（出现肺炎等症状）病毒则集中在下呼吸道表达。该病例的感染已经发展到下呼吸道，鼻咽部已不是主要感染区域，所以咽拭子反复检测都是阴性。另一方面，有研究指出呼吸道标本检出率由高到低为：肺组织>支气管肺泡灌洗液>抽吸痰或鼻咽吸取物>鼻咽拭子或口咽拭子>鼻拭子^[13,14,15]。由于该病例没有用肺泡灌洗液来做2019-nCoV核酸检测，其结论也仅仅是一种推断。

病例4，女，76岁，因发热（38 ℃）、咳嗽加重、呼吸困难，CT示双肺感染，2019-nCoV核酸检测阳性收入我院ICU，入院后连续2次核酸检测都是阴性，因病情好转入感染科继续治疗，但随后的2次核酸检测又转成了阳性。这种阳转阴、阴又转阳的患者在3 000多病例中并不少见，其中的原因可能有多种：（1）病情反复。患者某一阶段出现好转然后病情又再次加重。（2）治疗作用。某种药物将病毒压制到核酸检测下限，导致结果阴性，当药量减少或患者出院时，病毒载量又开始升高。（3）环节发生改变。人员变动（采样人员、实验操作人员、标本运输人员等）、试剂盒更换、仪器变动以及结果判读的差异。因此，通过这个病例，临床医生和实验室人员应该意识到由于2019-nCoV核酸检测影响因素众多，1~2次甚至连续3次的核酸阴性结果并不能保证病毒被完全清除，还需要通过临床症状、影像学结果以及其他检测指标综合判断。

目前，各厂家2019-nCoV核酸检测试剂盒灵敏度一般在500~1 000拷贝数/ml，提高2019-nCoV核酸检测灵敏度可以增加检出率、减低假阴性率，而试剂盒的灵敏度很大程度上受RNA提取方法的影响，主要包括：（1）提取量。国内现在一般是取200 μl的病毒保存液进行2019-nCoV核酸提取，而提取量的大小与初始病毒载量呈正相关，提取量越大，扩增前病毒载量也越大，假阴性率也就越低。（2）上样量。上样量指的是加入到PCR体系中的2019-nCoV核酸洗脱液体积，目前大部分试剂取5 μl模板上PCR仪扩增，存在丢失核酸的风险，核酸丢失会使PCR结果产生偏差而偏离真实值，如果增加上样量，就可以尽可能地增加初始病毒载量，防止假阴性的产生。（3）提取方法。目前2019-nCoV核酸提取方法主要为直接裂解法、柱提法和磁珠法，其中以磁珠法提取效率最高，可以有效降低假阴性，提高阳性检出率。

此外，需要注意的是，室内质控也是非常重要的一个环节。湖北省临检中心推荐2019-nCoV核酸检测每次上机采用"三阴一阳"的规则，既每批检测设立1个弱阳性质控和3个阴性质控，3份阴性质控需随机放在临床检测标本中。弱阳性质控测定为阳性，3份阴性质控全部测定为阴性，视为在控，反之，则为失控^[16]。2019-nCoV是RNA病毒，由于RNA的制备困难，很多公司的阳性参考品用的是质粒DNA或者PCR扩增产物来替代，但是DNA不参与提取和逆转录过程的质量控制，所以目前使用的质控品并不是严格意义上的阳性对照。从现有已申报注册的试剂来看，大多数厂家会设计3个基因区域的探针：ORF1ab基因、N基因（或E基因）和内标基因扩增序列，ORF1ab基因是2019-nCoV基因的特有序列，N基因（或E基因）是冠状病毒的共有序列，而内标基因能够准确监控提取、逆转录和荧光定量检测的全过程。因此，选择3个探针的试剂可以最大程度地提高检出率，降低假阴性。

目前，国内2019-nCoV核酸检测的室间质量评价（external quality assessment，EQA）还处于空白阶段，采样管的类型、核酸检测方法学选择（直接裂解法或磁珠法）以及检测探针数量等参数都没有一个行业标准，全国范围开展2019-nCoV核酸检测能力验证计划一方面将有助于比较不同厂家的试剂，选择高质量的核酸检测产品，另一方面也可以对不同检测机构的2019-nCoV核酸检测能力进行比对，校正各实验室测结果，帮助实验室发现假阴性/假阳性的原因。

2019-nCoV血清学检测产品已经研发出来，主要包括化学发光法和胶体金法，这两种方法都可以对目前核酸检测起到很好的补充，特别是胶体金法，操作简便、无需配套设备，10~20 min就可以判读结果。不同于核酸检测仅能在大型医院开展，胶体金法可以广泛应用于中小医院、社区诊所、乡村医疗卫生机构的筛查，在2019-nCoV疫情下一阶段防控中胶体金法将发挥重要作用。2019-nCoV胶体金法可检测病毒抗原和抗体，抗原检测标本类型主要为咽拭子，抗体检测标本类型包括咽拭子、全血、血清和血浆标本，其中，免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）可用于监测2019-nCoV的潜伏期或急性期，抗体IgG可用于监测2019-nCoV的病程初期和恢复期。需要指出的是，由于血清学抗体检测存在窗口期（从病毒进入人体到能用检测方法查出病毒抗体的这段时期）和个体免疫应答差异等影响因素，该方法对早期检测仍然存在假阴性的可能。

目前，武汉地区的核酸检测人员已连续工作多日，身心俱疲，但遇到核酸检测结果与临床症状、影像学检查不相符时，还是要保持高度的责任心，冷静分析问题，主动与临床医生沟通，询问患者病情、采样人员、用药以及留样时间等信息，必要时重新采样检测，在确认结果无误时，也要提醒临床医生结合患者的临床症状、影像学、核酸检测等结果进行综合判断。