比较7种国产新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂盒的一致性和检出能力，为临床实验室选择检测方法和新型冠状病毒肺炎的诊断提供参考依据。
收集深圳市罗湖区人民医院2020年1月29日至2月5日2019-nCoV感染确诊患者核酸检测阳性和疑似患者核酸检测阴性的咽拭子标本各10例，采用7种试剂盒（编号a~g）分别进行核酸检测，评价7种试剂盒临床标本检测结果的一致性；选取1份阳性标本核酸用无RNA酶水梯度稀释得到5个浓度梯度盘（浓度1~浓度5），比较不同品牌试剂盒的阳性检出率及批内重复性。
6种试剂盒检测20例临床标本的阴性和阳性符合率均为100%，仅1种试剂盒的阳性符合率为8/10，阴性符合率10/10；批内重复性显示7种试剂盒在浓度1水平重复检测病毒载量CV值均<5%；在浓度1~浓度3梯度区间，开放阅读框（ORF）1ab基因的检出能力比较显示b、d、f低于a、c、e、g，试剂盒e和g最高（14/15），a试剂盒对N基因检出能力可达15/15，优于其余5种试剂盒。ORF1ab和N基因检出能力综合分析显示d试剂盒检出能力最低（ORF1ab：40%；N：53%），a、b、c、e、f这5种试剂盒检出能力无明显差异。
7种试剂盒对病毒载量较高的阳性标本检测的准确度和重复性无明显差异，检测性能良好；但部分试剂盒对弱阳性标本的检出能力欠佳，建议弱阳性标本应至少采取两个厂家的试剂盒复核检验，以保障结果的准确性。
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新型冠状病毒（novel coronavirus，2019-nCoV）在分类学上属于冠状病毒β属，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，基因组为线性单股正链RNA病毒[1,2,3]。2020年1月中国研究人员通过高通量测序技术迅速获取了2019-nCoV全基因组序列及突变位点，并在国家基因组科学数据中心数据库正式发布[4]。国家卫生健康委员会最早发布的指南中提出RT-PCR检测病毒核酸是2019-nCoV感染诊断的金标准[5]。为了高效应对2019-nCoV疫情，仅1个月时间，6个2019-nCoV检测试剂盒通过了国家药品监督管理局批准用于2019-nCoV核酸检测。目前已有100多家企业和研发机构报道其2019-nCoV核酸检测试剂的成功研发。核酸检测类试剂盒是三类医疗器械，常规程序下试剂盒从研发、临床、批准需经过一系列严苛的临床验证与评估。迫于疫情强大的传播能力，应急审批的试剂盒以及屡屡报道的"假阴性"让临床对核酸试剂盒的检测能力产生质议，广泛采用的试剂盒质量是否真的良莠不齐，针对这一科学问题，本研究按照严格的质量评价体系对不同厂家核酸检测试剂盒的性能进行评价。
本研究参照CNAS-CL02-A009《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》[6]、CNAS-GL039《分子诊断检验程序性能验证指南》[7]和CLSI-MM03[8]等文件对7种国产2019-nCoV核酸检测试剂盒进行一致性和检出能力的研究，旨在建立多种核酸检测试剂盒分析性能的评价指标，提高后续潜在新发传染病病原的检测质量，并为检测机构选择合适的核酸检测试剂盒提供参考依据。
（1）阳性标本：收集2020年1月29日至2月5日在深圳市罗湖区人民医院初筛并由罗湖区疾病控制中心确诊的10例新型冠状病毒肺炎患者的临床检测后剩余的咽拭子标本。10例新型冠状病毒肺炎患者年龄31.5（12.0~58.0）岁；男6例，女4例。（2）阴性标本：①发热门诊就诊患者伴有干咳，乏力等疑似感染症状；②发热门诊就诊患者有武汉直接或间接接触或接触过感染患者；③新型冠状病毒核酸检测为阴性的疑似肺炎患者。收集满足上述入组条件的10例患者临床检测后剩余的咽拭子标本。咽拭子-80 ℃保存待测。本研究已通过罗湖区人民医院医学伦理委员会审核批准（2020-SZLH-LW-001），已获得患者知情同意。
选取7家试剂厂商提供的2019-nCoV核酸检测试剂盒，分别用a~g表示。a为梓健2019-nCoV核酸检测试剂盒（双重荧光PCR法，批号2020012801，深圳市梓健生物科技有限公司，简称梓健）；b为达安2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法，批号2020012，中山大学达安基因股份有限公司，简称达安）；c为伯杰2019-nCoV核酸检测试剂盒（双重荧光PCR法，批号20200127F，上海伯杰医疗科技有限公司，简称伯杰）；d为之江2019-nCoV核酸检测试剂盒（三重荧光PCR法，批号P20200208，上海之江生物科技股份有限公司，简称之江）；e为圣湘2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法，批号202004，圣湘生物科技股份有限公司，简称圣湘）；f为亚能2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法，批号NV20200209，亚能生物技术深圳有限公司，简称亚能）；g为华大2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法，批号6020200216，华大生物科技武汉有限公司，简称华大）。提取咽拭子标本的核酸统一采用宁波海尔施基因科技有限公司提供的核酸提取纯化试剂盒（批号REF1060167）。
NP968-C型核酸提取仪（天隆科技）；Heraeus fresco 21离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Eppendorf移液枪（德国Eppendorf公司）；Vortex-Genie2漩涡混合器（美国Scientific Industries公司）；ABI 7500 PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；HR50-IIA2海尔生物安全柜（中国青岛海尔生物医疗股份有限公司）。
20份咽拭子标本采用宁波海尔施基因科技有限公司提供的核酸提取纯化试剂盒和天隆半自动核酸提取仪严格按照试剂和仪器使用指南进行操作提取咽拭子中的RNA。按照产品说明书，7种试剂盒中，PCR反应体系华大RNA用量为10 μl，梓健、达安、伯杰、之江和亚能RNA用量为5 μl，圣湘模板加入的是5 μl RNA和15 μl无RNA酶水，体系为50 μl。RNA逆转录和real-time PCR反应程序根据厂商试剂说明书设置相应反应程序后使用同一台ABI7500 PCR分批进行扩增检测，并依据厂商说明书对检测结果进行判定。实验时使用各个厂商试剂盒所带的阴阳性对照对该批次试验进行质量控制，确保实验结果的可靠性。7种试剂盒中，之江和亚能提供的内标为装甲RNA，为了监测质量，将内标加入阴性质控中，随样品同批进行提取，然后扩增时加入该阴性质控。实验操作人员均为经过严格临床培训的执业临床技师，相关实验室管理规范和操作准则严格按照相关文件进行。
依据CLSI-MM03、CNAS-CL02-A009《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》和CNAS-GL039《分子诊断检验程序性能验证指南》以及相关试剂厂商说明书对7种新型冠状病毒核酸检测试剂盒进行一致性评价。选用上述收集的阴阳性咽拭子标本各10份，根据各厂商说明书对每份标本和相应试剂盒的阴阳性对照进行检测，记录检测结果。各靶标基因和阴阳符合率的判读依据相应厂商说明书。
选取1份经达安试剂盒ORF1ab检测结果Ct值为24.1、N基因Ct值为20.78的阳性标本提取的核酸，用无RNA酶水进行20、40、80、160和320倍浓度梯度稀释，得到1份经达安试剂盒ORF1ab检测结果Ct值为34.83、N基因Ct值为32.91的阳性标本，命名为浓度1，用无RNA酶水将其进行4、16、64和256倍浓度梯度稀释，最终得到浓度1、浓度2（1/4浓度1）、浓度3（1/16浓度1）、浓度4（1/64浓度1）、浓度5（1/256浓度1），共5个浓度梯度盘。使用7种试剂盒对每个梯度重复检测5次，记录阴阳性结果和各个靶标基因阳性检出率（阳性结果数/总测量次数）。
统计分析软件采用的是Excel 2010和GraphPad Prism5.0（美国GraphPad Software公司）。正态分布计量数据以
±s表示，非正态分布数据用M（Q1，Q3）表示。P<0.05为差异有统计学意义。
7种试剂均采用一步法逆转录聚合酶链式反应结合Taqman技术原理设计。7种试剂盒基本特征的比较见表1。a、b、c和e试剂为双靶标基因试剂，检测ORF1ab和N基因；d试剂检测ORF1ab、N基因和E基因3个靶标；f试剂检测ORF1ab、N基因和S基因3个靶标；g试剂仅检测ORF1ab。7种试剂中，a、b、e和g 4种试剂均为人源性内参基因作为内标，d和f 2种试剂的内标为装甲RNA，c试剂没有内标。a、b、c、d和f 5种试剂厂商声明的检出限均为1 000拷贝/ml，e试剂检出限为200拷贝/ml，g试剂的检测限最低，为100拷贝/ml。7种试剂均适用于咽拭子标本，磁珠法提取和ABI7500扩增仪扩增。
7种国产2019-nCoV核酸检测试剂盒的基本特征汇总
7种国产2019-nCoV核酸检测试剂盒的基本特征汇总
| 试剂盒名称 | 检测原理 | 内标 | 目标基因 | 检出限（拷贝/ml） | 标本类型 | 扩增仪 | 核酸提取试剂 | 反应体系模板/总体积（μl） | 循环数/cut-off值(Ct值） |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| a梓健 | 双重荧光PCR | RNase P | ORF1ab/N | 1 000 | 咽拭子/痰液 | ABI7500/Roche480 | QIAamp Viral RNA Mini Kit/梓健核酸提取或纯化试剂 | 5/25 | 40/37 |
| b达安 | 双重荧光PCR | 有 | ORF1ab/N | 1 000 | 咽拭子 | ABI7500/Roche480 | 适当核酸提取纯化试剂 | 5/25 | 45/40 |
| c伯杰 | 双重荧光PCR | 无 | ORF1ab/N | 1 000 | 上、下呼吸道标本/组织培养物 | ABI7500/BioCFX96/Roche480 | 上海伯杰医疗科技有限公司核酸提取及纯化试剂 | 5/25 | 40/38 |
| d之江 | 三重荧光PCR | 装甲RNA | ORF1ab/N/E | 1 000 | 咽拭子/痰液/肺泡灌洗液 | ABI7500/7900/Bio-Rad CFX96/SLAN | QIAamp Viral RNA Mini Kit/上海之江核酸提取试剂 | 5/25 | 45/43 |
| e圣湘 | 双重荧光PCR | RNase P | ORF1ab/N | 200 | 咽拭子/肺泡灌洗液 | ABI7500/Stratagene/SLAN-96P/96S | 圣湘生物科技股份有限公司标本释放剂 | 20/50 | 45/40 |
| f亚能 | 三重荧光PCR | 装甲RNA | ORF1ab/N/S | 1 000 | 咽拭子/痰液/肺泡灌洗液 | ABI7500/SLAN-96P/96S/Bio-Rad CFX96 | 广州美基生物科技有限公司核酸提取试剂 | 5/25 | 45/40 |
| g华大 | 荧光PCR | 有 | ORF1ab | 100 | 咽拭子/肺泡灌洗液 | ABI7500/SLAN-96P | QIAamp Viral RNA Mini Kit/天根生化科技有限公司核酸提取试剂 | 10/30 | 40/38 |
7种试剂对10份阳性临床标本靶标基因ORF1ab和N基因的检测结果和Ct值的分布见图1。根据各厂商说明书的判读标准，a、b、c、e、f和g 6种试剂对10份临床标本的阳性符合率为100%。d试剂对于10份阳性临床标本的ORF1ab基因检出率为80%（8/10），但对N基因、E基因检出率为10/10。根据d试剂的产品说明书，ORF1ab检出阳性才能判定为该标本新冠核酸阳性，故d试剂对临床阳性标本的检出率仅为8/10。除单靶标的g试剂外，6种试剂对10份阳性标本N基因的检出率为10/10，7种试剂对10份阴性标本检测的阴性符合率为10/10。d试剂对10份阳性临床标本ORF1ab检测的Ct值高于其他6种试剂（均值35.41；中位数35.57）；g试剂对10份阳性临床标本ORF1ab检测的Ct值最低（均值30.37；中位数31.54）（图1A、图1C）。d试剂盒对10份阳性临床标本N基因检测的Ct值高于其他6种试剂盒（均值33.04；中位数34.24）；f试剂对10份阳性临床标本N基因检测的Ct值最低（均值29.25；中位数31.59）（图1B、图1D）。
注：图A示7种试剂对10份阳性标本ORF1ab基因的检测结果；图B示7种试剂对10份阳性标本N基因的检测结果；图C示7种试剂对10份阳性标本ORF1ab基因扩增的Ct值分布；图D示7种试剂对10份阳性标本N基因扩增的Ct值分布；图中a、b、c、d、e、f、g分别代表梓健、达安、伯杰、之江、圣湘、亚能和华大7种试剂；d试剂对P3和P9阳性标本的ORF1ab基因末检出；e试剂对P4阳性标本的N基因末检出；g为能检测ORF1ab单靶标试剂
7种试剂重复检测结果及CV值见表2，根据厂商试剂说明书批内重复CV<5%，表示检测性能稳定。在浓度1浓度时，各试剂盒的批内CV均<5%，重复性优于浓度2浓度（部分试剂检测结果阴性）。浓度1和浓度2浓度范围内，e试剂盒两个靶标基因的CV值最低（ORF1ab为0.61%，N为0.33%），重复性最佳，其他5种试剂（a、b、c、d、f）对N基因检测的批内重复性普遍优于ORF1ab基因。在浓度1浓度时，g试剂对ORF1ab的检测Ct均值最低（30.37），6种试剂对N基因的检出能力良好（CV<5%）。
7种试剂盒在不同浓度梯度盘检测靶标的批内重复性结果
7种试剂盒在不同浓度梯度盘检测靶标的批内重复性结果
| 试剂 | 重复次数 | N基因 | ORF1ab基因 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 均值（拷贝/ml） | 标准差（拷贝/ml） | CV(%) | 均值（拷贝/ml） | 标准差（拷贝/ml） | CV(%) | |||
| 浓度1 | ||||||||
| a | 5 | 34.05 | 0.36 | 1.10 | 32.46 | 0.34 | 1.06 | |
| b | 5 | 33.81 | 0.19 | 0.56 | 35.17 | 0.45 | 1.28 | |
| c | 5 | 32.95 | 0.30 | 0.90 | 33.26 | 0.49 | 1.48 | |
| d | 5 | 34.85 | 0.33 | 0.94 | 35.91 | 0.43 | 1.19 | |
| e | 5 | 36.12 | 1.18 | 0.33 | 34.78 | 0.21 | 0.61 | |
| f | 5 | 33.46 | 0.24 | 0.70 | 34.10 | 0.45 | 1.34 | |
| g | 5 | / | / | / | 31.83 | 0.33 | 1.03 | |
| 浓度2 | ||||||||
| a | 5 | 36.16 | 0.26 | 0.72 | 35.71 | 0.59 | 1.66 | |
| b | 5 | 37.11 | 0.41 | 1.11 | — | — | — | |
| c | 5 | 36.61 | 0.46 | 1.25 | 36.89 | 0.80 | 2.16 | |
| d | 5 | — | — | — | — | — | — | |
| e | 5 | 39.01 | 1.07 | 2.75 | 38.71 | 0.38 | 0.97 | |
| f | 5 | 36.62 | 0.58 | 1.59 | — | — | — | |
| g | 5 | / | / | / | 35.13 | 0.63 | 1.78 | |
注：a、b、c、d、e、f和g分别代表梓健、达安、伯杰、之江、圣湘、亚能和华大7种试剂；g为能检测ORF1ab单靶标试剂；/示无数据；—示5份重复标本未完全检出
7种试剂对5个梯度盘核酸检测结果如图2所示。使用7种试剂对每个梯度重复检测5次。当浓度为浓度1时，7种试剂对所有标本检测结果均能检出，单个靶标基因（ORF1ab和N基因）的阳性检出率也为5/5。当浓度为浓度2时，b试剂和f试剂分别有2份和1份标本的ORF1ab基因未检出，其余靶标基因检出正常；d试剂仅在1份标本中检出ORF1ab；而N和E基因在1份标本中未检出，但该标本ORF1ab阳性，因此判断b、d和f这3种试剂对于ORF1ab的检出限在浓度1和浓度2之间，其中d试剂的N基因检出限也在此范围内。7种试剂在浓度3时对5份标本均未能完全检出，其中e和g试剂在浓度3时对ORF1ab基因检出率最高，为4/5，a和e试剂在浓度3时对ORF1ab基因检出率分别为3/5和2/5；对于N基因，a试剂在浓度3的检出率最高为5/5，由此可判断，对于ORF1ab基因，a、c、e和g试剂的检出限在浓度2和浓度3之间，其中a试剂对N基因的检测限低于浓度3；b、c、e和f四组试剂对N的检出限也在浓度2和浓度3之间。e试剂在浓度4和浓度5中对N基因的检出率各为40%，未检出ORF1ab。a、b、c、d、f和g试剂在浓度4和浓度5中均没有检出靶标基因。总体分析发现，在浓度1~浓度3梯度区间，e试剂和g试剂对ORF1ab的总体检出率最高（14/15）；其次为a试剂和c试剂（12/15）；d试剂的检出率最低（6/15）。a试剂对N的检出率最高（15/15）；其次为e试剂（14/15）；最低为d试剂（8/15）。
注：图A、B示浓度1浓度下7种试剂对ORF1ab和N靶标基因的检测结果；图C、D示浓度2浓度下7种试剂对ORF1ab和N靶标基因的检测结果；图E、F示浓度3浓度下7种试剂对ORF1ab和N靶标基因的检测结果；a、b、c、d、e、f和g分别代表梓健、达安、伯杰、之江、圣湘、亚能和华大7种试剂；g为能检测ORF1ab单靶标试剂
目前依靠临床表现、流行病史、CT影像学筛查及病原学检查等多角度实现了对2019-nCoV感染的快速筛查和诊断[9]。其中病原学检查是最精准的诊断方案，包括对病毒抗体和核酸检测，尤其是核酸检测最早被应用于2019-nCoV感染确诊。自2020年1月26日至2月26日，国家卫生健康委员会已批准10家新冠状病毒快速检测试剂盒，其中荧光PCR法有6家，这在以往医疗器械产品审批是前所未有的，据了解正在申请审批的试剂盒还为数不少。短短1个月，国产体外诊断行业为疫情的诊断和防控发挥了积极的推动作用，但与此同时，屡屡报道多次核酸检测为阴性、CT影像结合流行病学史已明显指征为新冠肺炎，核酸试剂检测能力备受争议[10]。为了解答广泛使用的试剂盒检测性能是否存在差异，有研究报道了6个厂家的批内重复性，但尚未研究比较不同厂家试剂盒的检出能力[11]。本研究收集具有疫区流行病学史疑似病例咽拭子核酸阴性标本和经临床确诊2019-nCoV核酸阳性标本，用国产7种试剂盒进行检测，评价不同厂家试剂盒对临床标本检测结果的一致性，同时利用梯度稀释的阳性核酸标本，比较7种国产试剂盒对不同病毒载量的检测能力，以期为临床实验室选择试剂盒、生产厂商改进试剂盒性能和2019-nCoV感染诊断提供依据。
本研究严格执行2019-nCoV检测规程，标本采集、标本保存和运输、标本提取、扩增仪器实行闭环模式，核酸检测由专业技术人员操作。通过对20份临床标本检测结果显示，7种试剂盒中除d试剂盒（三靶标）对临床标本的检测结果阳性符合率为8/10、阴性符合率为10/10外，其余6种试剂盒阴性和阳性符合率均为10/10，表明7种试剂盒对临床标本的检测结果基本一致。
根据产品说明书，d试剂盒可检测3个靶点（ORF1ab/N/E基因），实际临床标本分析10例阳性标本N和E基因均能检测，ORF1ab基因存在2例未检出，从病毒载量检测看ORF 1ab的Ct值要高于N、E基因的Ct值，可能是冠状病毒ORF1ab基因拷贝数相对N基因、S基因和E基因等编码结构蛋白的基因拷贝数更低[12]。多靶点检测，虽然可以减少因某一个基因突变导致扩增或探针杂交失败引起的漏检，但是多靶标同管扩增也可能由于多引物互相竞争而影响某个靶点检测的灵敏度，当然如果优化得好的话，也可能没有影响。7家试剂盒结果判读中4家双靶标主要采取双阳性则判定为阳性，任一靶标阳性重复检测依旧为阳性判为阳性；三靶标f试剂盒以至少单靶点为阳性，重复测定为阳性则可诊断为阳性。三靶标d试剂盒报告解读相对严苛，以ORF1ab靶标阳性为必要依据。g试剂仅检测ORF1ab靶标，重复检测2次均阳性即判断为阳性结果。g试剂盒厂商声明其检出限为100拷贝/ml，在7种试剂盒中最低，由图1C可知，单靶标检测试剂g的Ct值最低，提示检测敏感度最高，用于2019-nCoV感染的筛查更为合适，但存在因检测靶序列突变导致假阴性和存在近缘序列突变导致假阳性的风险。若用双靶标或三靶标试剂进行筛查，若仅出现单靶标阳性时，需进行复检或采取其他补充方法验证如基因测序分析是否产生位点突变，防止弱阳性标本的漏检。结合本研究的结果，建议d试剂盒厂家修订结果判读标准，不限定只有ORF1ab基因阳性才能判定标本检测结果阳性。
实验室选取1份阳性标本核酸制成5个浓度梯度盘（浓度1~浓度5），比较不同品牌试剂盒的阳性检出率及批内重复性。结果显示，7种试剂盒对浓度1重复检测5次，阳性检出率均为100%，表明对病毒载量较高的阳性标本其检出能力无明显差异。由图2可知，7种试剂盒对浓度2、浓度3的阳性检出率明显不同。E试剂在浓度4和浓度5中对N基因的检出率各为40%，末检出ORF1ab，a、b、c、d、f和g试剂在浓度4和浓度5中均没有检出靶标基因。综上所述，7种试剂盒对5个浓度梯度盘阳性检出能力，e和g对靶标基因的检出率最高，a、b、c和f次之，d对靶标基因的检出率最低。由表2可以看出，7种试剂盒中，e试剂盒批内重复性最佳。故由此推断e试剂对弱阳性标本的检出能力最突出，这与e试剂盒的检出限较低（厂商声明200拷贝/ml），对弱阳性标本检测位点可实现高灵敏检测有关，此外也与引物探针的设计有关。
文献[12]报道，某些临床诊断为2019-nCoV肺炎的患者核酸多次检测均为阴性，使临床对核酸检测的准确性产生了质疑。从本文研究结果可以看出，7种试剂盒对临床标本的阳性检出率除试剂d为80%外，其余均为100%，换言之，若标本中有较高浓度的病毒核酸，假阴性的可能性较小，但对弱阳性标本确实存在不能检出的风险，这是核酸检测结果与临床不符被认为"假阴性"的重要原因之一。除此之外，临床认为的"假阴性"最重要的原因是标本采集部位、采集量、标本保存和运输等分析前因素的影响，以及疾病进程中病毒载量的变化。实验室获得高质量的临床标本、严格按照技术操作规范操作，在疾病进程中多次采样复检，以及试剂厂商优化核酸提取试剂和PCR反应体系、提高其诊断特异度和敏感度是避免假阴性的重要措施。
受限于临床仅收集到同一地区的10例真实阳性标本，本研究无法严格依据核酸检测盒性能指标如采用具有时间和区域特征性的10个不同来源的病毒标本针对最低检出限、重复性等进行全面性能评价。本研究利用临床真实样品评价7种国产2019-nCoV核酸检测试剂盒的一致性和检测能力，为生产厂商优化产品和检测机构根据自身实验室的条件选择合适的核酸检测试剂盒提供一定的参考依据。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
