利用室间质量评价（EQA）评估实验室新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测项目的检测能力。
室间质量评价选用经特殊处理的2019-nCoV RNA作为EQA样本，甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒灭活临床样本作为阴性样本，分别评价其适用性、均匀性和稳定性后，将6份样本（第一轮不分组/第二轮分组）经冷链快递发送至参评实验室，要求实验室在规定时间内检测并回报检测信息和结果，然后对回报数据进行分析评价。
EQA样本适用于市面上主流核酸检测试剂。均匀性和稳定性均符合中国合格评定国家认可委员会对能力验证样品的要求。第一轮和第二轮分别收到有效回报结果243份和60份，回报结果完全正确的实验室分别为98.8%（240/243）和73.3%（44/60），成绩不合格实验室分别为1.2%（3/243）和26.7%（16/60）。第一轮和第二轮样本的整体符合率分别为99.8%（1 455/1 458）和94.7%（341/360），其中假阳性率分别为0.1%（1/729）和2.5%（3/120），假阴性率分别为0.3%（2/729）和6.7%（16/240）。
目前参评实验室对2019-nCoV核酸检测的整体能力较好，假阴性结果是影响其检测的主要问题。各实验室在常规应用相关试剂前，应对不同厂家试剂进行性能验证与比对。
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新型冠状病毒（2019-nCoV）传染性强、传播迅速，可引起新型冠状病毒肺炎（COVID-19）［1, 2, 3］。早期诊断是控制疫情的关键，依据相应诊疗方案，2019-nCoV核酸检测阳性是COVID-19疑似病例的确诊依据［4］。为有效应对疫情，国家药品监督管理局（national medical products administration，NMPA）先后通过应急审批流程批准了6家公司生产的2019-nCoV核酸检测试剂，随后陆续有上百家公司宣称研发出相应产品并用于临床。但不同厂商试剂检测能力存在差异［5］，加之标本质量和人员操作等因素均会对临床诊断产生较大影响。在实际临床应用中，确实经常碰到核酸检测假阳性和假阴性情况，尤以后者为甚［6, 7, 8, 9］。先前研究表明不同实验室严重急性呼吸道综合征冠状病毒和中东呼吸综合征冠状病毒核酸检测结果间存在差异［10, 11, 12］。为评估国内实验室2019-nCoV核酸检测能力，本中心首次开展了2019-nCoV核酸检测的室间质量评价（external quality assessment，EQA）活动，以期发现实验室相关项目存在的问题，进一步改善和提高其检测质量。
1. 样本：EQA样本由上海之江生物科技股份有限公司提供，阳性样本为2019-nCoV（SARS-CoV-2/ZJU-01/Human/2020）抽提的RNA加入不同体积的特定保存液制备而成，其主要成分为异硫氰酸胍、Tris-HCl缓冲液和表面活性剂等，需经核酸抽提才能进行后续核酸检测过程；为与其他已知的常见呼吸道感染病原体相鉴别，采用灭活的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒临床样本制备成阴性样本，置于-20 ℃保存备用。
2. 仪器与试剂：ABI 7500荧光定量PCR仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）、Centrifuge 5424R高速离心机（德国Eppendorf公司）、QX ONE微滴式数字PCR系统（美国Bio-Rad公司）；QIAamp Viral RNA Mini Kit（德国凯杰公司）、2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）分别由上海之江、华大生物、上海捷诺、达安基因、圣湘生物和上海伯杰公司提供、2019-nCoV核酸检测试剂盒（数字PCR法）由中国计量科学研究院提供。
1.EQA样本RNA提取：选取阳性EQA样本，参照QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒说明书提取2019-nCoV RNA，溶于60 μl DEPC处理水中，置于-20 ℃保存备用。
2.EQA样本定值：将2019-nCoV RNA用焦碳酸二乙酯处理水10倍稀释，参照2019-nCoV核酸检测试剂盒（RT-ddPCR法）说明书，使用QX ONE微滴式数字PCR系统进行微滴生成、一步法RT-PCR扩增和信号读取，每靶基因重复检测3次，直接计算靶基因在PCR反应体系中的平均拷贝数浓度（copies/μl）。RT-ddPCR反应体系：一步法反应缓冲液5 μl、酶混合液2 μl、DTT 2 μl、20×OFR1ab/N基因/E基因反应液1 μl、抽提的RNA样本5 μl、无RNA酶水6 μl。数字PCR反应条件：反转录45 ℃ 10 min，1个循环；预变性95 ℃ 5 min，1个循环；变性95 ℃ 15 s，退火延伸58 ℃ 30 s，40个循环，微滴固定98 ℃ 10 min。
3.样本验证：选用上海之江、华大生物、上海捷诺、达安基因、圣湘生物和上海伯杰2019-nCoV核酸检测试剂盒，分别对未抽提/已抽提的RNA进行检测，结果判定以厂家说明书为准，以验证EQA样本是否适用于已批准的商品化试剂盒。
4.均匀性评价：参照CNAS-GL003∶2018《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》中关于均匀性的评价要求［13］，每批样本从-20 ℃随机抽取10支，采用2019-nCoV核酸检测试剂盒（上海之江）进行检测，每支重复测定2次，以评估样本的均匀性。
5.稳定性评价：为确保EQA样本稳定性，随机抽取-20 ℃保存的各浓度质控品6支，置于2~8 ℃，在第10天取出，用2019-nCoV核酸检测试剂盒（之江生物）检测，和-20 ℃检测结果进行比较。
6.EQA方案设计：2020年2月下旬和3月上旬，本中心先后组织实施了两轮EQA活动。两轮EQA样本盘均为6支样本，其中阳性样本3~4份，阴性样本2~3份（表1）。第1轮EQA样本编号均相同，为防止实验室间串通数据，第2轮EQA将样本分成3组，组内样本编号一致，但组间样本编号不一致。
2019-nCoV核酸检测EQA样本盘结果
2019-nCoV核酸检测EQA样本盘结果
| 样本编号 | 预期结果 | 预期浓度（拷贝/ml） | 符合率（%,n/n） | 假阳性率（%,n/n） | 假阴性率（%,n/n） | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 第1轮 | 99.8（1 455/1 458） | 0.1（1/729） | 0.3（2/729） | |||
| 2011 | 阴性 | 0 | 100（243/243） | 0（0/243） | / | |
| 2012 | 阳性 | 2.59×104 | 99.6（242/243） | / | 0.4（1/243） | |
| 2013 | 阴性 | 0 | 100（243/243） | 0（0/243） | / | |
| 2014 | 阳性 | 2.59×105 | 100（243/243） | / | 0（0/243） | |
| 2015 | 阳性 | 5.18×104 | 99.6（242/243） | / | 0.4（1/243） | |
| 2016 | 阴性 | 0 | 99.6（242/243） | 0.4（1/243） | / | |
| 第2轮 | 94.7（341/360） | 2.5（3/120） | 6.7（16/240） | |||
| 2011 | 阳性 | 2.59×103 | 78.3（47/60） | / | 21.7（13/60） | |
| 2012 | 阳性 | 2.59×104 | 100（60/60） | / | 0（0/60） | |
| 2013 | 阴性 | 0 | 96.7（58/60） | 3.3（2/60） | / | |
| 2014 | 阳性 | 2.59×105 | 96.7（58/60） | / | 3.3（2/60） | |
| 2015 | 阳性 | 5.18×104 | 98.3（59/60） | / | 1.7（1/60） | |
| 2016 | 阴性 | 0 | 98.3（59/60） | 1.7（1/60） | / | |
注：“/”表示不存在假阳性率或假阴性率情况，EQA为室间质量评价
7. EQA方案组织形式：2019-nCoV核酸检测EQA活动为自愿参加，本中心将样本盘经冷链快递运输至各参评实验室，不指定检测方法，要求其在规定时间内（自样本接收1周内）用实验室常规检测系统检测，所用检测试剂、方法和结果通过网络系统上报。
8. EQA方案结果评价：鉴于2019-nCoV核酸检测结果对临床决策和防控所起的重要作用，此两轮EQA按以下原则进行判定：回报结果100%符合为合格，否则为不合格。同时，计算各样本的整体符合率、假阳性率和假阴性率。
9.统计学分析：用SPSS 16.0统计软件进行。均匀性评价用单因素方差分析，稳定性评价用两独立样本的t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
6种商品化2019-nCoV试剂盒分别检测抽提的RNA，结果显示不同靶基因（ORF1ab/N基因/E基因，依试剂盒检测靶标不同而异）均呈典型S形扩增曲线，而未抽提的EQA样本无特异性扩增曲线，这表明EQA样本适用于市面上主流2019-nCoV核酸检测试剂，可用于后续EQA活动中，见图1。
注：A为上海之江试剂检测结果，B为华大基因试剂检测结果，C为上海捷诺试剂检测结果，D为达安基因试剂检测结果，E为圣湘生物试剂检测结果，F为上海伯杰试剂检测结果
阴性样本经检测无特异性扩增曲线，均为阴性。阳性样本检测结果显示ORF1ab、N基因和E基因均呈典型S形扩增曲线，按照试剂盒结果判定规则为阳性。均匀性评价以ORF1ab基因Ct值为准，结果表明样本均匀性良好（P>0.05）（表2）。
阳性EQA样本均匀性检测结果
阳性EQA样本均匀性检测结果
| 样本编号 | 预期Ct值 | 检测Ct值 （ˉx±s） | CV（%） | F值 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|
| 2011 | 36.3 | 36.2±0.6 | 1.7 | 1.0 | 0.49 |
| 2012 | 33.0 | 32.7±0.4 | 1.2 | 2.0 | 0.14 |
| 2014 | 29.7 | 29.3±0.4 | 1.5 | 1.8 | 0.19 |
| 2015 | 32.0 | 31.4±0.5 | 1.4 | 1.9 | 0.15 |
注：EQA为室间质量评价
阳性样本2~8 ℃保存10 d与-20 ℃保存检测结果（以ORF1ab基因Ct值为准）比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表3），这表明EQA样本在2~8 ℃保存10 d稳定性良好，可满足样本的传递要求。
阳性EQA样本稳定性检测结果（ˉx±s)
阳性EQA样本稳定性检测结果（ˉx±s)
| 样本编号 | 2~8 ℃ | -20 ℃ | t值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| 2011 | 36.1±0.3 | 36.5±0.6 | 0.2 | 0.16 |
| 2012 | 33.4±0.2 | 33.2±0.2 | 1.5 | 0.17 |
| 2014 | 30.1±0.2 | 29.7±0.4 | 1.9 | 0.08 |
| 2015 | 31.8±0.4 | 31.5±0.6 | 1.1 | 0.30 |
注：EQA为室间质量评价
两轮报名参加的实验室为291家和65家，规定时间内收到有效回报结果243份和60份，有效回报率分别为83.5%和92.3%。两轮回报结果的实验室分别来自全国25个省（自治区、直辖市）和20个省（自治区、直辖市）。第一轮参评实验室中102家为医院检验科、132家为第三方医学检验所、2家为疾控中心、6家为检验检疫机构、1家为其他机构（研究院）；第二轮参评实验室中14家为医院检验科，44家为第三方医学检验所，1家为检验检疫机构、1家为其他机构（研究院）。
两次EQA活动中，使用率较高的试剂均为经NMPA批准的商品化试剂，其中第一轮使用率排名前3的为上海之江（30.1%）、圣湘生物（18.9%）和达安基因（11.7%），第二轮使用率排名前3的为圣湘生物（34.4%）、上海伯杰（16.4%）和达安基因（11.5%）（图2）。两轮EQA活动中，参评实验室中最为常用的方法为实时荧光逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法（97.9%和98.3%），仅有个别实验室使用数字PCR、微阵列芯片-飞行时间质谱、恒温扩增法和下一代测序（next generation sequencing， NGS）法（表4）。
注：A为参评实验室第一次试剂使用情况，B为参评实验室第二次试剂使用情况，试剂使用实验室少于3家则归入其他试剂组
参评实验室所用方法和检测能力（家）
参评实验室所用方法和检测能力（家）
| 检测方法 | 实验室数 | EQA结果 | |
|---|---|---|---|
| 合格 | 不合格 | ||
| 第1轮 | 243 | 240 | 3 |
RT-PCR | 238 | 236 | 2 |
数字PCR | 1 | 1 | 0 |
微阵列芯片-飞行时间质谱 | 1 | 1 | 0 |
恒温扩增 | 1 | 1 | 0 |
NGS | 2 | 1 | 1 |
| 第2轮 | 60 | 44 | 16 |
RT-PCR | 59 | 43 | 16 |
数字PCR | 1 | 1 | 0 |
注：EQA为室间质量评价，NGS为下一代测序
按照结果评价原则，第一轮243家实验室（98.8%）回报结果完全正确，3家实验室（1.2%）成绩不合格，其中医院检验科1家，第三方医学检验所2家；第二轮44家实验室（73.3%）回报结果完全正确，16家实验室（26.7%）成绩不合格，其中医院检验科2家，第三方医学检验所14家，见表4。
两轮EQA活动中，第一轮和第二轮样本的整体符合率分别为99.8%和94.7%（表1）。第一轮EQA活动中，2011、2013和2014号样本全部符合，2012、2015和2016号样本均出现1份样本不合格情况。但在第二轮EQA活动中，仅2012号样本全部符合，其他样本均出现不符合情况，特别是2011号样本符合率最低仅为78.3%。不合格结果中，第一轮有1家实验室出现1个假阳性结果，2家实验室各出现1个假阴性结果；第二轮有3家实验室各出现1个假阳性结果，但有16家实验室各出现1个假阴性结果，其中3家实验室同时出现假阳性和假阴性结果（表1）。
作为COVID-19疑似病例确诊的明确指标，及时准确的核酸检测对于新冠肺炎疫情防控具有重要意义。EQA结果显示两轮实验室合格率分别为98.8%（240/243）和73.3%（44/60）。相比第一轮，第二轮合格率有较大幅度降低（73.3%），这与先前EQA报道不相一致［14, 15］。究其原因主要有两点：（1）新增了低浓度样本；（2）样本的分组设置。第一轮EQA时多地区因疫情原因交通管制，造成物流时间大幅延长，为避免样本出现降解而未加入低浓度样本，主要考察了实验室检测的准确性和特异性。结合第一轮反馈情况和样本稳定性检测结果（表3），样本的稳定性可得到有效保证，因此第二轮中我们对低浓度样本的检出能力进行了考核。从回报结果来看，68.4%（13/19）的假阴性结果均为此样本导致，说明实验室对低浓度样本的检出能力较弱，这也与临床常见假阴性情况相符［6, 7, 8, 9］。本研究所用低浓度样本量值约为2 590 拷贝/ml，这高于NMPA已批准所有2019-nCoV核酸检测试剂所声明的检出限（≤1 000 拷贝/ml）。但先前研究表明2019-nCoV核酸检测试剂检出限存在显著差异，因此检测试剂的实际检出限可能是导致假阴性结果的原因之一［5］。此外，参评实验室使用了种类繁多的核酸提取试剂，包括国产和进口、有证与无证、手工与仪器法等，其所提取样本量和洗脱体积亦存在较大不同，抽提效率可能存在明显差异，这也可能导致了部分假阴性结果。此外，假阴性结果很大程度上可能为人为因素所致，特别是疫情应急状态下部分检测人员能力不足，如手工提取核酸操作失误导致RNA抽提得率低、加样不熟练导致漏加错加样本、对单靶标样本解读能力不足导致结果错判等。其次，为避免实验室间比对结果，我们将第二轮EQA样本分为3组（组内编号一致，组间编号不一致）后分别发送至实验室。后期与参评实验室沟通后证实这种防串通措施也是合格率明显降低的原因之一。本研究中假阳性情况较为少见，即便在更真实反映实验室检测能力的第二轮活动中，也仅有2.5%的假阳性结果。其主要原因可能是人员操作（如交叉污染）所致。鉴于其对临床决策所产生的不利影响，实验室应进一步强化人员培训并规范其操作，且在检测过程中应加入多个阴性质控品（如3份）以最大程度避免此种情况发生［6， 8， 16］。
从回报数据来看，参评实验室普遍应用的方法还是RT-PCR法，因其更为简单成熟可靠，仅有少数实验室使用其他方法，如恒温扩增法和数字PCR法等。目前NMPA批准的大多数试剂盒也是采用RT-PCR法。但即便对于已批准试剂，因其未经充分临床验证与性能优化，产品质量可能存在参差不齐情况，因而实验室在常规使用前应对其性能进行验证。此外，两轮EQA活动中均有近30%实验室使用未经批准的试剂或实验室自建方法，其产品质量如何需进一步进行性能确认。值得注意的是，部分实验室使用了2种或以上试剂进行结果复核，在临床采用此种方法可在一定程度上保证检测结果更为准确。
临床患者标本、质粒DNA、人工制备标本和病毒RNA等均可用于病毒核酸检测的EQA活动中［17］。其中，人工制备的包裹2019-nCoV目标RNA序列的噬菌体颗粒是一种较好形式的样本［18］，但此技术无法包裹片段过长的ORF1ab基因（约21 290 bp），而只能选择包装权威机构（如中国CDC、WHO和美国CDC等）推荐的部分ORF1ab基因片段。研究初期，我们也评估了3个厂家生产的假病毒颗粒，但其均无法全部适用于已获批商品化试剂盒。因而，我们选择2019-nCoV RNA作为EQA样本，其无生物传染性，且经特殊处理也须参与核酸抽提过程。本研究结果证实其均匀性和稳定性良好，可适用于目前市面上所有商品化检测试剂，能充分模拟临床样本用于2019-nCoV核酸检测能力评估。本研究局限性为未对实验室检测不同靶基因的能力进行评价。考虑到绝大多数试剂检测靶标为2或3个基因，今后我们也将重点对此过程进行评估，以便更全面地评价临床实验室的检测能力。
综上，本研究结果表明部分实验室2019-nCoV核酸检测能力有待进一步提高。此外，实验室在常规应用核酸检测试剂前，应对不同厂家试剂进行性能验证与比对，这对于降低临床假阴性风险、有效控制病毒传播具有重要意义。实验室应不断加强自身能力建设，切实做好室内质控、室间质评并强化人员培训等工作，以进一步提高2019-nCoV核酸检测质量。
所有作者均声明不存在利益冲突
