探讨二十碳五烯酸(EPA)对胶质瘤U87细胞替莫唑胺(TMZ)化疗敏感性的影响及其机制。
(1)体外常规培养U87细胞,加入0、25、50、100、200 μmol/L EPA分别作用12、24、48 h后MTT检测细胞增殖率;(2)将U87细胞分为对照组、EPA组、TMZ组、EPA+TMZ组(EPA、TMZ的浓度分别为25、100 mol/L,EPA预处理时间为12、24或48 h,TMZ作用时间为24 h),MTT检测4组细胞的增殖抑制率;(3)将U87细胞分为对照组、EPA组、TMZ组、EPA+TMZ组(EPA、TMZ的浓度分别为25、100 mol/L,作用时间分别为12、24 h)。流式细胞术检测4组细胞凋亡率;Western blotting检测细胞活化半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达,DNA错配修复酶(MGMT)及核因子κB(NF-κB) p65、NF-κB抑制蛋白(IKBα)的表达;免疫荧光染色检测细胞MGMT和NF-κB p65的表达;甲基化特异性PCR(MSP)法检测细胞MGMT基因启动子甲基化水平。
(1)50、100、200 μmol/L EPA作用12、24、48 h时对U87细胞的增殖抑制呈浓度和时间依赖性;(2)与同样预处理时间的TMZ组比较,EPA+TMZ组U87细胞的增殖抑制率均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);(3)流式细胞术检测显示:与TMZ组[(34.58±4.35)%]比较,EPA+TMZ组U87细胞的凋亡率[(53.28±5.05)%]明显升高,差异有统计学意义(P< 0.05);Western blotting检测显示:与TMZ组比较,EPA+TMZ组U87细胞活化caspase-3、Bax和IKBα蛋白表达升高,MGMT和NF-κB p65蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);免疫荧光染色显示EPA+TMZ组细胞MGMT和NF-κB p65蛋白的表达低于TMZ组;MSP检测显示EPA+TMZ组U87细胞MGMT基因启动子甲基化水平高于TMZ组。
EPA预处理可提高胶质瘤U87细胞对TMZ的化疗敏感性,其机制可能是通过下调NF-κB信号通路抑制MGMT表达来实现。
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胶质瘤特别是胶质母细胞瘤(WHO分级Ⅳ级)的恶性程度极高,肿瘤边界不清楚,单纯手术切除无法彻底根治,术后以烷化剂替莫唑胺(temozolomide,TMZ)为基础的辅助化疗己成为胶质瘤治疗的重要辅助措施[1,2]。TMZ是新一代咪唑类衍生物,可以甲基化O-6鸟嘌呤位点,造成肿瘤细胞DNA碱基错误配对,改变核染色体稳定性,进而诱导肿瘤细胞凋亡。TMZ的临床应用已证实其能够明显延长患者生存期,改善患者预后[1]。但胶质瘤化疗后继发高表达的DNA错配修复酶(MGMT)与TMZ耐药密切相关。MGMT能够修复TMZ诱发的鸟嘌呤甲基化,修复DNA损伤,从而使瘤细胞对TMZ化疗产生耐药性[3,4,5]。二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)作为免疫营养素ω-3多不饱和脂肪酸(omega-3 polyunsaturated fatty acids,ω-3 PUFA)的重要营养成分之一,能通过氧化代谢为机体提供热量,还可介导脂质合成改变细胞膜膜性,起到抗氧化应激和调控细胞内凋亡因子基因表达的作用[6]。研究表明EPA对多种肿瘤细胞增殖均有抑制作用,可明显提高肿瘤的治疗疗效[7,8,9]。但EPA对胶质瘤细胞TMZ化疗敏感性的影响,特别是MGMT基因启动子甲基化及表达在其中的作用目前尚不清楚。本研究通过观察EPA预处理对TMZ作用的胶质瘤U87细胞增殖、凋亡和活化半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达,MGMT及核因子κB(NF-κB)通路相关蛋白表达,MGMT基因启动子甲基化水平的影响,探讨EPA对胶质瘤细胞TMZ化疗敏感性的影响及其机制,以期为EPA的应用和胶质瘤的治疗提供实验基础。