探讨载多柔比星磁性纳米颗粒(DOX-MNP)逆转人骨肉瘤细胞多药耐药性的可行性。
以人骨肉瘤多药耐药细胞株R-OS-732为实验对象，应用荧光显微镜观察DOX-MNP进入肿瘤细胞及其在细胞内分布的情况，采用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测DOX-MNP对肿瘤细胞的增殖活性的影响，采用Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术检测DOX-MNP对肿瘤细胞凋亡的影响。
荧光显微镜观察发现与游离DOX相比，DOX-MNP在肿瘤细胞内尤其在细胞核内积聚更多；MTT实验表明DOX-MNP抑制肿瘤细胞增殖的效应较游离DOX更强；流式细胞术结果表明DOX-MNP促进肿瘤细胞坏死，而游离DOX促进细胞凋亡。
DOX-MNP对人骨肉瘤多药耐药细胞株R-OS-732的体外杀伤效应较游离DOX更强，能够逆转其多药耐药性。
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骨肉瘤是最常见的骨的恶性实体瘤，多累及青少年及儿童，预后不良。除手术切除外，综合化疗是其主要治疗手段。然而化疗药物的剂量限制性毒性及肿瘤细胞的多药耐药性(multidrug resistance，MDR)严重影响骨肉瘤的化疗效果[1]。因此，近年来化疗研究的焦点集中于开发一种能实现靶向化疗并能克服肿瘤细胞MDR的新型药物转运系统。磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles，MNP)载药系统因其磁响应性强、生物相容性好、生物降解可控性强、载药量高及靶向修饰可能性等优势而受到广泛关注[2,3,4,5]。目前，有研究表明纳米颗粒载药系统能够逆转人白血病细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞的MDR[6,7,8]。为了探讨MNP载药系统逆转骨肉瘤MDR的可行性，本实验研究了载多柔比星磁性纳米颗粒(DOX-MNP)对人成骨肉瘤多药耐药细胞株R-OS-732的体外杀伤效果。
多柔比星(doxorubicin，DOX)购自北京华奉联博科技有限公司，DOX-MNP由中国科学院高能物理研究所制备提供，低温离心机为美国Beckman公司产品，酶标仪为芬兰Labsystem公司产品，IX70荧光显微镜为美国Olympus公司产品。
人骨肉瘤多药耐药细胞株R-OS-732由解放军总医院骨科研究所实验室冻存，RPMI 1640培养液为美国Hyclone公司产品。
调整细胞密度至1×105个／ml，均匀接种到6孔培养板上爬片，每孔加入细胞悬液2 ml。培养24 h待细胞贴壁后，吸弃上清液，每孔加入2 ml预先配制的含有游离DOX及DOX-MNP的培养液，使各组所含的DOX终质量浓度均为4 μg/ml。培养60 min，取出爬片用甲醇／丙酮(1∶1)固定液4 ℃固定5 min。PBS漂洗后用1 μg/ml Hoechst 33258染核1 min。PBS漂洗后，置于载玻片上立即在荧光显微镜下观察，以488 nm波长观察两组药物进入细胞及其在细胞内分布的情况。
调整细胞密度至1×105个／ml，均匀接种到96孔培养板，每孔加入细胞悬液0.2 ml，培养24 h待细胞贴壁后，吸弃原培养液，加入0.2 ml预先配制的含有DOX及DOX-MNP的培养液。实验设定5个DOX浓度组：0.625、1.25、2.5、10、40 μg/ml，空白对照组只加等量的培养液，每组设定3个复孔。将培养板置于37 ℃，5 % CO2培养箱中培养48 h后，每孔加入MTT 10 μl，充分反应4 h，吸出150 μl上清液，同时加入DMSO 150 μl，混匀10 min后，在酶标仪上测定各孔在570 nm处的吸光度(A)值，按下列公式计算细胞相对增殖率。
细胞相对增殖率(％)＝(实验组A570均值／对照组A570均值)×100 %
调整细胞密度为5×105个／ml，取2 ml均匀接种于25 cm2细胞培养瓶内，置于37 ℃，5 % CO2培养箱中培养24 h使细胞贴壁。吸弃上清液，分别加入预先配制的含有DOX及DOX-MNP的培养液，使DOX终质量浓度为10 μg/ml。培养48 h后收集各组细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS重悬细胞并计数，调整细胞密度为1×106个／ml。取2 ml细胞，冷PBS漂洗2次(1 000 r/min，4 ℃离心10 min)后悬浮细胞。按照试剂盒说明书加入200 μl Binding Buffer重悬细胞。加入10 μl Annexin V-FITC混匀后加入10 μl PI，轻轻混匀，室温避光反应15 min。加入300 μl Binding Buffer，30 min内用流式细胞仪检测各组细胞存活率、早期凋亡率、晚期凋亡率、坏死率。
应用SPSS 13.0软件分析数据，结果以平均值±标准差(
±s)表示，P<0.05认为差异有统计学意义。
DOX-MNP由中国科学院高能物理研究所制备提供。DOX-MNP以超顺磁Fe3O4粒子为内核，以右旋糖酐(DEX)作为包覆层装载抗肿瘤药物DOX，以聚乙二醇(PEG)修饰颗粒表面，其结构模式如图1。透射电子显微镜及粒径分布检测结果(图2)显示，DOX-MNP纳米颗粒呈球形，单分散性好，粒径分布均匀，平均粒径为(6.9±1.4) nm。
DEX：右旋糖酐包覆层；Fe3O4：四氧化三铁磁性内核；DOX：多柔比星；PEG：聚乙二醇修饰物
将人骨肉瘤多药耐药细胞株R-OS-732与DOX及DOX-MNP共培养，利用Hoechst 33258染细胞核呈蓝色及DOX内在的红色荧光特性，在荧光显微镜下可以观察到DOX及DOX-MNP进入肿瘤细胞及其在细胞内的分布情况(图3)。DOX组的红色荧光主要集中在细胞质，细胞核中红色荧光强度极低，表明游离DOX能够跨过肿瘤细胞膜进入细胞，但是难以进入细胞核内；DOX-MNP组的红色荧光在细胞质及细胞核内均可被观测到，且荧光强度均高于DOX组，表明DOX-MNP能够大量进入细胞质及细胞核。
单纯MNP在预实验中证实自身无细胞毒性。然而本实验发现DOX-MNP对R-OS-732细胞显示出了极强的增殖抑制效应(图4)。计算出DOX-MNP组对R-OS-732细胞的半数抑制剂量(IC50)为5.77μg/ml，仅为DOX组(IC50为23.53 μg/ml)的1/4。
采用Annexin V-FITC/PI双荧光标记，流式细胞术检测细胞凋亡情况(图5)。结果显示：单纯MNP组的细胞存活率与空白对照组差异无统计学意义，提示单纯MNP对R-OS-732细胞无杀伤作用；DOX组能够诱导R-OS-732细胞凋亡，凋亡率达到74.88%，坏死率仅有8.51 %；而DOX-MNP组对R-OS-732细胞杀伤作用更强，细胞坏死率高达59.37 %，凋亡率仅19.75 %。
骨肉瘤是一类最常见的骨科恶性肿瘤，主要累及青少年及儿童。尽管近年来其预后得到了很大改善，5年生存率也仅达到70 %[9]。化疗药物的剂量限制性毒性及肿瘤MDR的产生是影响肿瘤化疗效果的两个难题。MDR是指肿瘤细胞对多种结构不同、作用靶点不同的化疗药物产生交叉耐药，是导致肿瘤化疗失败的重要原因之一[10]。因此，克服肿瘤细胞MDR是肿瘤化疗的关键。本实验发现MNP载药系统可有效增强DOX对多药耐药的骨肉瘤细胞株R-OS-732的杀伤效应，能够逆转其MDR。
纳米颗粒载药系统的一大优势是因EPR效应(enhanced permeation and retention, EPR)而易于积聚到实体瘤组织内。这种现象主要是由于实体瘤组织内血管丰富且连续性差，以及淋巴循环不畅，使纳米颗粒通过血液循环聚集在肿瘤部位。这属于其被动靶向机制。除此之外，还可通过纳米颗粒表面修饰特定靶向分子实现主动靶向转运。MNP除具备以上优势，还可在外部磁场作用下积聚到肿瘤部位，并可同时实现靶向化疗、可控释放及热疗。据报道应用纳米载药系统，肿瘤部位的药物浓度比其他正常组织器官高45～200倍[11]。
化疗药物发挥效力还与其在肿瘤细胞内的积聚、分布有关[12]。蒽环类抗生素DOX的作用机制是通过嵌入DNA，引发拓扑异构酶Ⅱ破坏DNA的三级结构[13]。据报道，蒽环类抗生素在耐药肿瘤细胞内不但积聚减少，细胞内分布情况也发生改变。在敏感细胞内主要分布在细胞核，而在耐药细胞内主要分布在细胞质。这种现象在多种耐药肿瘤细胞都有发现[14]。本实验用荧光显微镜也观察到类似现象，游离DOX的红色荧光主要集中在细胞质，胞核中红色荧光强度极低。然而，DOX-MNP组的红色荧光在细胞质及细胞核内均可被观测到，且其荧光强度均高于DOX组，表明纳米载药系统能够增加DOX在细胞内尤其是在细胞核内的积聚。
预实验已证实所用浓度范围的单纯纳米颗粒MNP无细胞毒性，这与文献报道相符[15,16,17,18]。这表明DOX-MNP对R-OS-732细胞的增殖抑制效应只能归因于DOX-MNP中所携载的DOX。然而DOX-MNP对R-OS-732骨肉瘤细胞的增殖抑制效应均强于对应浓度的DOX，其半数抑制剂量IC50仅是DOX的1/4。这种增强的增殖抑制效应或许能用荧光观察结果解释。然而肿瘤细胞MDR产生机制复杂，至今尚未完全被阐明[19]。当前研究较广泛的耐药机制主要包括属于ATP超家族的P-糖蛋白(P-gp)和MDR相关蛋白-1(mrp-1)。P-gp及mrp-1具有细胞膜离子"泵"样作用，可以将细胞内的药物"泵"到细胞外，降低细胞内药物浓度从而产生耐药，但是很多耐药性的产生并不能以此单一机制来解释[20]。对于DOX-MNP克服肿瘤细胞MDR尤其是在细胞核内积聚的确切机制，仍有待深入研究。
一些体外研究认为纳米载药颗粒通过激活凋亡信号转导通路促进细胞死亡[21,22]，另有研究认为其导致细胞死亡是通过坏死的方式而不是通过凋亡途径[23,24,25]。本研究通过流式细胞术发现DOX-MNP比DOX显示出更高的坏死率，而DOX显示出极高的凋亡率。因此流式细胞术结果支持后者的论断，即DOX-MNP通过促进肿瘤细胞坏死杀伤细胞，较DOX的促进凋亡途径杀伤效应更强。然而，该论断尚缺乏分子生物学证据的支持，有必要进一步进行凋亡和坏死相关蛋白的检测。
总之，本研究通过体外实验观察，证实MNP载药系统能够增强化疗药物对MDR肿瘤细胞的杀伤效应，逆转其MDR，可降低药物有效剂量及全身毒性，为进一步体内研究提供了理论依据。
