构建环氧合酶2 (COX-2)慢病毒载体，并建立高表达COX-2乳腺癌细胞株MCF7，研究COX-2在乳腺癌细胞增殖中的作用。
利用COX-2 PCR全长引物和COX2的cDNA载体获得COX-2编码区全长PCR产物。经限制性内切酶BamHⅠ和XholⅠ切割PCR产物及慢病毒载体plvx-DsRed-Monomer-N1，连接酶连接，转化，测序，进而获得慢病毒载体plvx-COX-2-DsRed。后经嘌呤霉素筛选，得到带有红色荧光标记的稳定高表达COX-2乳腺癌细胞系MCF7-plvx-COX-2-DsRed，并利用实时PCR和Western blot进行验证。利用平板克隆和Western blot对比高表达COX-2 MCF7细胞系与正常MCF7细胞系的增殖能力的差异。
利用PCR技术获得COX-2载体后，筛选获得稳定高表达COX-2乳腺癌细胞系MCF7-plvx-COX-2-DsRed。生长曲线检测示，第2天起MCF7-plvx-COX-2-DsRed细胞较MCF7及MCF7-plvx-DsRed-Monomer-N1细胞生长速度明显增快（P<0.05），平板克隆实验亦得出一致结果。经过蛋白相对定量分析，MCF7-plvx-COX-2-DsRed细胞株较MCF7和MCF7-plvx-DsRed-Monomer-N1细胞株的c-myc的表达量多（P<0.05），β-catenin表达量减少（P<0.05）。
成功构建慢病毒载体plvx-COX-2-DsRed和高表达COX-2乳腺癌细胞株，并在RNA和蛋白水平加以验证。COX-2可能通过上调c-myc的表达，增强MCF7细胞增殖能力。
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环氧合酶2 （COX-2）在前列腺素及其产物合成过程中有重要作用。COX-2在炎症、神经细胞和肿瘤组织中表达，而在正常组织中无表达。以往的研究主要集中于COX-2与炎症的关系等方面，近几年研究发现COX-2在多种肿瘤组织中高表达，且与肿瘤的恶性度呈正相关性。我们对COX-2基因进行克隆并构建慢病毒载体，筛选高表达COX-2的乳腺癌稳定株，发现COX-2可以通过增强Wnt-β-catenin信号通路的活性增强癌细胞的增殖能力，这为进一步研究COX-2在乳腺癌干细胞生物学行为中的作用奠定了基础。
人乳腺癌细胞株MCF7和人肾上皮细胞株293T购于中国医学科学院上海细胞库；COX-2 cDNA克隆载体购于上海吉凯基因公司；PCR试剂盒、反转录试剂盒、割胶回收试剂盒购于大连宝生物公司以及北京全式金公司；引物于上海Invitrogen公司合成；T4 DNA连接酶购于北京全式金公司；TRIzol、Lipofectamine 2000及SYBR Green PCR Master Mix购于上海Invitrogen公司；DMEM培养液和胎牛血清购于美国Gibco公司；靶向COX-2 (ab52237，美国Abcam公司)、β-actin （66009，美国Proteintech武汉公司）、β-catenin （51067-2-AP，美国Proteintech武汉公司）、c-myc (10057-1-AP，美国Proteintech武汉公司)抗体为一抗；二抗为山羊抗鼠抗体（NJ178769，美国Thermo公司）、山羊抗兔抗体（MG159266，美国Thermo公司）。药品均购于美国Sigma公司。
293T细胞培养于10％胎牛血清的DMEM培养液中，5 % CO2，37 ℃条件下培养；MCF7细胞培养于含10％胎牛血清、0.01 % mg/ml胰岛素的DMEM培养液中，5 % CO2，37 ℃条件下培养。
购买COX-2 cDNA克隆载体，严格遵守PCR引物设计原则，BLAST检索引物特异性，利用NCBI设计COX-2全长引物（表1）。PCR反应总体系10 μl，其中上下游引物（10 μmol/L）各0.2 μl，5 × TransStart FastPfu Fly缓冲液2 μl, dNTP (2.5 mmol/L) 1 μl, 5× TransStart FastPfu Fly DNA聚合酶0.2 μl，其余体积用双蒸水补齐。反应条件：95 ℃预变性，2 min；95 ℃变性10 s, 60 ℃退火20 s, 72 ℃延伸，20 s, 30个循环；进一步72 ℃延伸5 min; 4 ℃保存。产物1815 bp。将PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，用割胶回收试剂盒回收PCR产物。用限制性内切酶BamHⅠ和XholⅠ37 ℃进行PCR回收产物和载体plvx-DsRed-Monomer-N1的双酶切，经过纯化试剂盒纯化酶切产物后，用T4 DNA连接酶作用载体和PCR产物，于16 ℃连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌感受态细菌中，将细菌涂布于含100 mg/L氨苄青霉素的LB平板上，倒置平板，转移到37℃生化培养箱中培养过夜。次日，挑取阳性克隆菌（plvx-COX-2-DsRed）小摇，小提后，用限制性内切酶BamHⅠ和XholⅠ进行酶切验证，得到阳性结果的克隆来源送测序。
扩增各基因引物序列
扩增各基因引物序列
| 基因 | 序列（5'→3'） |
|---|---|
| COX-2-1 | 正义TAACTCGAGATGCTCGCCCGCGCCCTGCT |
| 反义CGGGATCCGCCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCAGTTCAGTCGAACGTTCT | |
| COX-2-2 | 正义GTTCCACCCGCAGTACAGAA |
| 反义AGGGCTTCAGCATAAAGCGT | |
| β-actin | 正义TTGCCGACAGGATGCAGAAGGA |
| 反义AGGTGGACAGCGAGGCCAGGAT |
注：COX-2为环氧合酶2; COX-2-1用于获得COX-2全长, COX-2-2用于获得该基因片段
将293T细胞接种于6孔板中，待细胞生长至密度达80％左右时，将培养液换成无血清的DMEM培养液，饥饿培养细胞1 h，根据Lipofectamine 2000 Reagent产品说明准备转染培养液。将无血清培养液换成含有转染质粒的培养液，4 h后再将培养液换成正常细胞培养所用培养液。于转染72 h后收集蛋白。
利用0.001％的多聚赖氨酸包被6孔板，置于细胞培养箱1 h，取出后用PBS冲洗6孔板3次，再置于细胞培养箱2 h干燥细胞培养板。在此6孔板中，种合适密度293T细胞，待细胞贴壁生长至密度70%～80％时，用预热的无血清DMEM培养液饥饿处理1 h。将质粒psPAX2、pMD2.G、转染的重组质粒plvx-COX-2-DsRed或转染慢病毒载体质粒plvx-DsRed-Monomer-N1以质量比3∶1∶4共10 μg加至1 ml的无血清DMEM培养液中，放置5 min；将Lipofectamine 2000以25 μl/ml DMEM培养液配好，放置5 min；将混好的质粒逐滴滴入Lipofectamine 2000中，放置20 min后加入细胞中。培养细胞16 h，换为正常培养液，培养至转染后24 h，收集病毒液，4 ℃保存；继续培养细胞24 h，再次收集病毒液，将两次收集的病毒液以离心半径10 cm，2 000 r/min离心5 min，保留上清液，用0.22 μm的滤器过滤，分装后在-80 ℃长期保存。
在6孔板中接种乳腺癌MCF7细胞，待细胞生长至密度达50%～70％时，用无血清DMEM培养液饥饿处理细胞2 h，用1 μl polybrene DMEM的病毒液4 ml/孔替代无血清的DMEM培养液，培养细胞过夜后，换成正常细胞培养液，继续培养细胞2 d。开始向细胞培养液中加入2 μg/ml的嘌呤霉素，同时向未作处理的对照组MCF7细胞中加入等量嘌呤霉素，待对照组的细胞死亡后，实验组存活的经转染的MCF7细胞就是稳定表达转染载体的细胞，再继续扩增，并进行RNA和蛋白的验证。
收集正常未作处理的MCF7细胞、稳定转染了空载体的MCF7细胞和稳定转染了表达载体的MCF7细胞，提取RNA，反转录后获得cDNA，进行实时定量PCR。应用上述引物，进行实时PCR扩增，总反应体系10 μl：模板cDNA 2 μl；上下游引物（10 μmol/L）各0.2 μl；SYBR Green PCR Master Mix 5 μl；双蒸水补足体积。反应条件：50 ℃预变性2 min，95 ℃ 2 min; 95 ℃变性15 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s，循环40次。实验重复3次，每个样品有3个复孔。仪器平台：Mx3005P, Agilent。分析方法：Quantitation Comparative CT。2-ΔΔCt法计算出Power值，比较基因表达差异，并用3次独立实验验证差异是否存在统计学意义。
细胞经过消化后，以500个／ml的密度接种于6 cm培养皿，培养14 d，每3 d更换培养液。4％的多聚甲醛溶液固定30 min，0.5％的结晶紫染色20 min，用水清洗干净培养板后拍照。
消化离心细胞后，充分重悬细胞液，计数细胞。MCF7、MCF7-plvx-COX-2-DsRed、MCF7-plvx-DsRed-Monomer-N1三组细胞分别以4 000~ 5 000/ml的同等密度接种于96孔板，每孔加入细胞悬液200 μl，各组设6个复孔，铺板共3块；分别在24、48、72 h后，向各孔中分别加入5 mg/ml MTT 20 μl, 37 ℃培养4 h。弃除每孔内液体，向每孔中加入200 μl DMSO，振荡摇匀后利用酶标仪在490 nm下检测各组吸光度（A值）。重复实验3次，分别比较三种细胞株在24、48、72 h的A值。绘制细胞生长曲线。
收集瞬时转染了空载体plvx-DsRed-Monomer-N1、慢病毒载体plvx-DsRed-Monomer-COX-2的293T细胞和正常293T细胞；收集正常未做处理的MCF7细胞、稳定转染了空载体的MCF7细胞和稳定转染了表达载体的MCF7细胞，用PBS洗涤2次后，加入适量RIPA裂解液制备蛋白样品。利用考马斯亮蓝法对蛋白进行相对定量，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，经过转膜，脱脂奶粉封闭，一抗（COX-2 1∶1 000，β-actin 1∶100 000，β-catenin 1∶1 000, c-myc 1∶1 000）于4 ℃反应过夜。二抗（山羊抗鼠抗体1∶5 000，山羊抗兔抗体1∶5 000）于室温培养1 h，利用ECL发光液和BioRad凝胶成像仪进行发光并采集图像，对条带相对定量。
应用GraphPad Prism 5统计学软件分析。计量资料用
±s表示，采用配对t检验分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
以cDNA进行PCR产物的扩增，经过琼脂糖凝胶电泳后，得到一条接近2 000 bp的条带，与COX-2实际扩增大小（1 815 bp）接近，即得到目的基因COX-2的扩增产物。
M1 ：DL5000 Marker; M2：DL2000 Marker
经双酶切、琼脂糖凝胶电泳显示，三个样品质粒皆为阳性，可看到分别接近10 000 bp和2 000 bp的两条带（图2），与原空载体和插入的目的基因COX-2片段大小一致。将此克隆测序，测得结果与已知野生型COX-2序列一致，提示COX-2序列已经成功克隆到慢病毒载体plvx-DsRed-Monomer-N1中。
M ：DL10000 Marker；A、B、C均为plvx-DsRed-Monomer-COX-2; 1、2、3均为plvx-DsRed-Monomer-COX-2酶切产物
将构建好的慢病毒载体转染到293T细胞中，72 h后进行Western blot检测，结果显示在293T细胞中COX-2蛋白水平表达增强（图3），提示该载体转入细胞可以提高COX-2的表达，为研究COX-2基因对乳腺癌干细胞及其对细胞生物学行为的影响提供了可能。
1：293T细胞株；2：转染空载体plvx-DsRed-Monomer-N1的293T细胞；3：转染plvx-DsRed-Monomer-COX-2的293T细胞
经过病毒液的感染，成功获得转染效率80％以上的带有红色荧光标记的细胞（图4）。收集细胞采用实时PCR检测，高表达COX-2稳定细胞株的COX-2 RNA水平表达量是正常细胞株的75.29倍（21.74±0.01 ，P<0.05）和转染空载体细胞株的64.91倍（25.89±0.38，P<0.05）；Western blot检测进一步验证稳定株COX-2基因的表达高于未转染和转染空载体的细胞（图5）
MCF7-plvx-DsRed-Monomer-COX-2
1：MCF7细胞；2：转染空载体plvx-DsRed-Monomer-N1的MCF7细胞；3：转染plvx-DsRed-Monomer-COX-2的MCF7细胞
平板克隆实验显示，MCF7-plvx-COX-2-DsRed细胞株的增殖能力强于MCF7-plvx-DsRed-Monomer-N1细胞株（图6）。MTT绘制细胞生长曲线显示，第2天起MCF7-plvx-COX-2-DsRed细胞株较MCF7细胞生长速度增快（P<0.05 ）；而MCF7-plvx-DsRed-Monomer-N1细胞与MCF7细胞的生长差异无统计学意义（P>0.05）（图7）。
6A：MCF7细胞；6B：转染空载体plvx-DsRed-Monomer-N1的MCF7细胞；6C：转染plvx-DsRed-Monomer-COX-2的MCF7细胞
Western blot检测Wnt⁃β⁃catenin通路中c⁃myc及β-catenin蛋白水平，发现MCF7-plvx-COX-2-DsRed细胞c-myc相对表达水平高于MCF7和MCF7-plvx-DsRed-Monomer-N1细胞（均P<0.05）；而MCF7-plvx-COX-2-DsRed细胞β-catenin相对表达水平低于MCF7细胞和MCF7-plvx-DsRed-Monomer-N1细胞（均P<0.05）（图8）。
1：MCF7细胞；2：转染空载体plvx-DsRed-Monomer-N1的MCF7细胞；3：转染plvx-DsRed-Monomer-COX-2的MCF7细胞
293T来源于人胚肾细胞，携带了SV40T抗原的具有高度转染能力。这种细胞能够让含有SV40区域的质粒得以复制，是转染载体的最佳工具[1]。乳腺癌细胞MCF7的COX-2蛋白表达水平低于恶性度高的三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231（数据未发表），因而该细胞株是探究在肿瘤背景下，细胞高表达COX-2与肿瘤恶性度改变、COX-2与各种靶基因关系的良好工具。
环氧合酶1（COX-1）和COX-2是花生四烯酸代谢成前列腺素的限速酶。COX-1在多种组织中持续表达，而COX-2在炎症和细胞分裂时被诱导表达，已有研究发现在多种肿瘤中COX-2均高表达[2,3]。在临床前期研究中，抑制COX-2具有增强肿瘤细胞对化疗药物敏感性的作用[4,5]。COX-2能够促进乳腺癌的血管生成，促进乳腺癌骨转移[6]。这些研究充分说明COX-2在恶性肿瘤中的研究价值，探究COX-2在乳腺癌发生发展的分子通路成为亟待解决的问题。
已有文献报道，COX-2在乳腺癌细胞株MCF7中具有诱导基因组不稳定、bcl-2高表达、多柔比星耐药和肿瘤形成早期细胞表型改变的作用[7]。肿瘤干细胞是目前已得到广泛认知的具有自我更新能力的一类肿瘤细胞，它与肿瘤转移和耐药密切相关。已有文献报道COX-2在膀胱癌中可能参与干性基因表达的调控[8]，COX-2在乳腺癌类干细胞中具有重要作用[9]。本实验成功扩增COX-2基因的编码序列，并成功构建慢病毒载体plvx-DsRed-Monomer-COX-2。在此基础上，经过筛选得到带有红色荧光融合蛋白DsRed标记的高表达COX-2基因的稳定株。我们发现COX-2可以通过目前较公认的干性通路Wnt-β-catenin增强乳腺癌细胞系的增殖能力。红色荧光融合蛋白表达稳定，不干扰细胞正常生理，为我们后续利用三维培养模拟体内肿瘤细胞的生长、分析干性蛋白与COX-2在核质定位关系奠定了基础。稳定株的构建避免了使用药物对多种网络中相互复杂作用的影响，解决了瞬时转染随时间降解而不能应用于肿瘤干细胞长期培养的问题。COX-2高表达效率接近100 %，其所能引起的生物学效应与肿瘤的关系可以更加直接得以体现。该基因在分子通路中作用的探究将为临床靶向治疗提供可能。
