研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(TSA)对结直肠癌Lovo细胞株5-氟尿嘧啶(5-Fu)化疗敏感性的影响及可能的机制。
实验分为对照组、5-Fu组、TSA组、TSA预处理组、TSA+5-Fu联合组。分别于加药后24、48和72 h用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞增殖情况，Transwell法检测干预24 h后的细胞侵袭力，流式细胞术检测干预24 h后细胞凋亡率的变化，Western blot法检测干预24 h后细胞中胸苷酸合酶(TS)蛋白的表达水平。
与对照组相比，5-Fu组、TSA预处理组及TSA+5-Fu联合组细胞24、48、72 h生长受到抑制(P<0.05)；与5-Fu组相比，TSA预处理组及TSA+5-Fu联合组48、72 h细胞生长抑制明显(P<0.05 )；TSA预处理组与TSA+5-Fu联合组生长抑制率差异无统计学意义(P>0.05 )。干预24 h后，对照组、5-Fu组、TSA组、TSA预处理组及联合组细胞穿膜数分别为(25.0±4.2)、(16.8±2.8)、(19.6±2.5)、(8.2±3.2)、(6.5±2.6)个，组间差异有统计学意义(P<0.05)，凋亡率分别为(4.26±1.36)%、(11.66±3.18)%、(8.57±2.69)%、(39.79±8.53)%、(45.18±10.07)%，组间差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，各用药组细胞穿膜数下降、细胞凋亡率升高(P<0.05)，TSA预处理组及TSA+5-Fu联合组细胞穿膜数、细胞凋亡率较5-Fu组变化明显(P<0.05)，而TSA预处理组与TSA+5-Fu联合组之间细胞穿膜数、细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。对照组与5-Fu组细胞TS蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；与对照组及5-Fu组相比，TSA组、TSA预处理组及TSA+5-Fu联合组细胞TS蛋白表达下调(P<0.05)，而TSA组、TSA预处理组及TSA+5-Fu联合组细胞TS蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。
TSA能够增强5-Fu对结直肠癌Lovo细胞的化疗敏感性，这种作用可能是通过下调TS蛋白实现的。
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结直肠癌(colorectal cancer，CRC)的发生发展是一个多基因、多步骤的复杂过程，已证实的机制主要有染色体不稳定和微卫星不稳定[1,2]。近年来，许多研究发现表观遗传机制也参与其中。组蛋白乙酰化修饰是一种重要的表观遗传修饰方式，其中组蛋白的去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)可使基因表达沉默，表现为抑癌基因低乙酰化，已有研究证实HDAC功能异常与肿瘤的发生、发展有密切联系[3,4]。目前治疗CRC的主要化疗药物为5-氟尿嘧啶(5-Fu)，因为耐药性及对正常细胞的毒性，限制了其在临床中的应用。HDAC抑制剂(histone deacetylase inhibitors，HDACi)是一种新的抗肿瘤药物，它可通过提高组蛋白的乙酰化水平调控基因的转录和表达[5,6]，与一些抗肿瘤化疗药联用，可增强化疗药物的敏感性[7,8]。但在CRC中，HDACi对药物化疗敏感性影响的研究尚少。本研究用一种较为广谱的HDACi曲古霉素A(TSA)，对CRC细胞株Lovo进行处理，探讨TSA对CRC传统化疗药5-Fu的化疗敏感性的影响及可能机制。
TSA(美国Sigma公司)，5-Fu(上海旭东海普公司)，F12k培养液(武汉博士德公司)，无支原体胎牛血清(杭州四季青公司)，四甲基偶氮唑盐(MTT)(武汉博士德公司)，AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒(美国Beckman公司)，胸苷酸合酶(thymidylate synthase, TS)单抗(北京中杉金桥公司)。
Lovo细胞购自中国科学院上海细胞库，常规复苏后用含10％胎牛血清和1％双抗(青霉素、链霉素)的F12k培养液，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，根据细胞生长情况平均每2 d换液及传代接种，传代前用D-Hanks平衡液漂洗，0.25％胰酶消化。取对数生长期的细胞进行实验。实验分组：对照组(不加药)、5-Fu组(0.75 μg/ml 5-Fu)、TSA组(150 ng/ml TSA)、TSA预处理组(150 ng/ml TSA预先处理12 h，更换0.75 μg/ml 5-Fu继续干预)、联合组(150 ng/ml TSA+0.75 μg/ml 5-Fu)。
将细胞以1×104/ml接种于96孔板，总体积200 μl。待细胞生长至对数生长期时加入各组药物，每组设6个重复孔。分别于加药后24、48和72 h行MTT检测：加入5% MTT 20 μl，培养4 h，弃去培养液，加入150 μl二甲基亚砜(DMSO )，室温轻摇5 min，酶标仪测定490 nm波长下的吸光度(A)值。计算细胞生长抑制率。
细胞生长抑制率=(1-A实验孔/A对照孔)×100 %
将100 μl 2×105/ml的细胞悬液接种于上室，实验组上室按干预条件含不同药物，下室加入600 μl含20％胎牛血清的F12k培养液。37 ℃、5 % CO2条件下培养。24 h后取出上室，用棉签除去上层细胞，用甲醛溶液固定，苏木精染色，置于倒置显微镜下观察细胞通过情况，随机计数10个视野(×200)细胞，取平均值进行统计分析。实验重复3次。
收集干预24 h后的各组细胞，用冷却的PBS洗涤2次，1×binding buffer调整细胞密度为105/ml，加入5 μl的AnnexinV稀释液混匀，再加入2.5 μl的PI混匀。避光、冰上反应10 min，加入1 × binding buffer 400 μl，于30 min内用流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)检测细胞凋亡情况。
干预24 h后提取各组细胞总蛋白，以β-actin为内参照，采用12% SDS-PAGE凝胶垂直电泳分离TS蛋白，然后转移至NC膜，5% BSA室温下封闭，加一抗，4 ℃过夜，加二抗，室温作用2 h，用DAB显色，采用Band Scan图像分析系统进行分析，计算蛋白条带灰度值。以目的蛋白与内参照蛋白灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。
采用SPSS 16.0统计软件，计量资料以
±s表示，单因素多组比较用方差分析，组间多重比较用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。
经MTT法检测，与对照组相比，5-Fu组、TSA预处理组及联合组细胞干预24、48和72 h生长受到抑制，TSA组细胞48 h和72 h生长受到抑制(P<0.05)。与5-Fu组相比，TSA组细胞无明显生长抑制(P>0.05)，TSA预处理组及联合组细胞48 h和72 h生长抑制明显(P<0.05 )。TSA预处理组与联合组细胞生长抑制率差异无统计学意义(P>0.05)(图1、表1)。
各药物干预不同时间结直肠癌Lovo细胞生长抑制情况(吸光度值，
±s)
各药物干预不同时间结直肠癌Lovo细胞生长抑制情况(吸光度值，±s)
| 组别 | 样本数 | 干预24h | 干预48 h | 干预72h | |
|---|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 6 | 0.788 2 ± 0.032 4 | 0.812 0 ±0.038 4 | 0.884 4±0.063 7 | |
| 5-Fu组 | 6 | 0.606 9±0.024 8a | 0.517 8 ± 0.035 0a | 0.383 1 ± 0.071 6a | |
| TSA组 | 6 | 0.702 3 ± 0.057 3 | 0.642 6 ± 0.046 6a | 0.529 6 ± 0.029 7a | |
| TSA预处理组 | 6 | 0.537 0 ±0.011 1a | 0.442 8 ± 0.057 4ab | 0.281 7 ±0.052 7ab | |
| 联合组 | 6 | 0.513 5 ± 0.027 9a | 0.380 8 ± 0.029 6ab | 0.234 2 ± 0.016 8ab | |
| F值 | 33.963 | 48.877 | 78.128 | ||
| P值 | <0.05 | <0.05 | <0.05 | ||
注：5-Fu为5-氟尿嘧啶；TSA为曲古霉素A；对照组为不加药物组；TSA预处理组为TSA预先处理12 h后更换5-Fu继续干预组；联合组为TSA+5-Fu组；与干预相同时间对照组比较，aP<0.05；与干预相同时间5-Fu组比较，bP<0.05
5-Fu: 5-氟尿嘧啶；TSA：曲古霉素A；TSA预处理组：TSA预先处理12 h后更换5-Fu继续干预组；联合组：TSA+5-Fu组；与同时间点5-Fu组比较，aP<0.05
干预24 h后，对照组、5-Fu组、TSA组、TSA预处理组及联合组细胞穿膜数分别为(25.0±4.2)、(16.8±2.8)、(19.6±2.5)、(8.2±3.2)、(6.5±2.6)个(F=37.70，P<0.05)。与对照组相比，其他4组细胞的穿膜数下降(P<0.05 )；与5-Fu组相比，TSA组细胞穿膜数差异无统计学意义(P>0.05)，TSA预处理组及联合组细胞穿膜数降低(P<0.05)；TSA预处理组与联合组细胞穿膜数差异无统计学意义(P>0.05)(图2)。
2A：对照组(不加药)；2B: 5-Fu组；2C: TSA组；2D: TSA预处理组(TSA预先处理12 h后更换5-Fu继续干预)；2E：联合组(TSA+5-Fu)；5-Fu：5-氟尿嘧啶；TSA：曲古霉素A
对照组、5-Fu组、TSA组、TSA预处理组及联合组细胞干预24 h的凋亡率分别为(4.26±1.36)%、(11.66±3.18)%、(8.57±2.69)%、(39.79±8.53)%、(45.18±10.07)%(F=28.234，P<0.05)。与对照组相比，5-Fu组、TSA组、TSA预处理组及联合组细胞的凋亡率升高(P<0.05 )；与5-Fu组相比，TSA组细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05 )，TSA预处理组及联合组细胞凋亡率升高(P<0.05 )；TSA预处理组与联合组凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)(图3)。
3A：对照组(不加药)；3B: 5-Fu组；3C: TSA组；3D: TSA预处理组(TSA预先处理12 h后更换5-Fu继续干预)；3E：联合组(TSA+5-Fu)；5-Fu：5-氟尿嘧啶；TSA：曲古霉素A
对照组、5-Fu组、TSA组、TSA预处理组及联合组细胞干预24 h后TS蛋白的相对表达量分别为3.925 4±0.771 6、3.773 5±0.692 0、2.287 9±0.416 2、2.075 2±0.333 1、1.893 3±0.321 1(F=9.809，P< 0.05)。与对照组相比，5-Fu组TS蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05 )，TSA组、TSA预处理组及联合组TS蛋白相对表达量下降(P<0.05)；与5-Fu组相比，TSA组、TSA预处理组及联合组细胞TS蛋白相对表达量下降(P<0.05 )；TSA组、TSA预处理组及联合组细胞TS蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)(图4)。
A：对照组(不加药)；B: 5-Fu组；C：TSA组；D：TSA预处理组(TSA预先处理12 h后更换5-Fu继续干预)；E：联合组(TSA+5-Fu)；5-Fu ：5-氟尿嘧啶；TSA：曲古霉素A; TS：胸苷酸合酶
近年来，导致CRC发生发展的表观遗传机制越来越受到重视，组蛋白乙酰化修饰是其重要方面。正常情况下，组蛋白乙酰化与去乙酰化过程处于动态平衡，由组蛋白乙酰化酶(HAT)和HDAC共同调控。前者有利于DNA与组蛋白解离，核小体结构松弛，使各种转录因子能与DNA结合位点特异性结合，激活基因转录，而后者使组蛋白去乙酰化，基因转录受到抑制，表达沉默，抑癌基因失活。HDACi可使组蛋白恢复乙酰化。何向明等[9]研究表明，HDACi西达苯胺(chidamide)可诱导CRC细胞周期阻滞、细胞凋亡。目前有关HDACi在CRC中应用的研究也多集中在抑制细胞增殖、促凋亡及周期阻滞等方面，关于HDACi对5-Fu化疗敏感性的影响及其机制的研究尚少。本研究采用一种较为广谱的HDACi TSA，探讨其对CRC的主要化疗药物5-Fu化疗敏感性的影响及可能的机制。
本研究采用MTT法检测各药物对Lovo细胞增殖的影响。与对照组相比，5-Fu组、TSA预处理组及联合组干预24、48、72 h后细胞生长受到抑制，而TSA组在48、72 h细胞生长受到抑制，与5-Fu组相比，干预各时间点TSA组细胞生长抑制的差异无统计学意义(P>0.05)，TSA预处理组及联合组在48、72 h对细胞生长有明显抑制，TSA预处理组与联合组间细胞生长抑制的差异无统计学意义，提示5-Fu经TSA预处理或与TSA联用在一定条件下可提高其化疗敏感性。细胞侵袭能力与肿瘤的恶性程度密切相关，穿膜细胞数的多少可以反映细胞侵袭能力大小。用药24 h后，与对照组相比，各用药组穿膜细胞数均明显下降，TSA预处理组与联合组穿膜细胞数较5-Fu组明显减少，但二者之间穿膜细胞数差异无统计学意义(P>0.05)，提示TSA与5-Fu均可在一定程度上降低肿瘤细胞的恶性程度，5-Fu经TSA预处理或与TSA联用降低肿瘤细胞恶性程度的能力更为显著。本研究还发现，相较于对照组，各药物组处理24 h后的Lovo细胞凋亡率明显升高，与5-Fu组相比，TSA预处理组及联合组凋亡率升高明显，而TSA预处理组与联合组之间差异不明显，提示TSA可能通过促进凋亡途径抑制Lovo细胞的增殖，增强了5-Fu的化疗敏感性。以上实验中，TSA单用时并不优于5-Fu，但TSA预处理组和联合组的细胞增殖抑制能力、降低侵袭能力及促凋亡能力均明显增强。TSA预处理组各药物用药时间短，但与联合组作用无明显差异，且比5-Fu单独用药作用显著，提示TSA可明显提高5-Fu的化疗敏感性，干预停止后仍对5-Fu的作用有影响，提示TSA可作为5-Fu的一种有效辅助药物，提高5-Fu的疗效。
TS可催化尿嘧啶脱氧核苷一磷酸(dUMP)甲基化为胸腺嘧啶脱氧核苷一磷酸(dTMP)，而dTMP为DNA的生物合成所必需。5-Fu通过对TS进行靶向抑制而发挥抗癌活性：5-Fu在体内经一系列酶促反应，最后转变为活性代谢产物氟尿嘧啶脱氧核苷一磷酸(FdUMP)。FdUMP能与5, 10-亚甲基四氢叶酸(5, 10-CH2FH4)及TS形成三联复合物，影响dUMP与TS的结合，使DNA的合成受限[10]。已有研究证实胃肠道癌组织中TS的表达水平与患者对5-Fu的化疗敏感性及患者的预后密切相关，TS表达水平高的患者对5-Fu化疗不敏感[11,12,13]。Fakih等[14]研究也表明，TS的过表达与临床5-Fu的耐药性相关，且HDACi伏立诺他(vorinostat)可在转录水平下调TS的表达，增加5-Fu的活性代谢产物dUTP，与5-Fu联用具有协同抗肿瘤效应。Lee等[10]发现HDACi可通过乙酰化热休克蛋白90 (HSP90)最终增加HSP70与TS的结合，使TS的表达下调，逆转5-Fu的耐药性。也有研究发现，HDACi可以抑制TS基因的转录[15]。但国内涉及HDACi与TS间关系的研究尚鲜见报道。本研究应用Western blot检测药物干预24 h后对照组、5-Fu组、TSA组、TSA预处理组及二药联合组Lovo细胞中TS的表达水平，发现对照组与5-Fu组差异不明显，而与对照组及5-Fu组相比，TSA组、TSA预处理组及联合组TS蛋白表达明显下调，但三者之间差异无统计学意义，提示细胞对5-Fu的耐药性与TS蛋白表达增加有关，TSA可能通过下调TS蛋白表达来提高5-Fu的化疗敏感性。
已有研究证实，HDACi在CRC中可在一定程度上抑制肿瘤细胞增殖，阻滞细胞周期，促进凋亡。本研究在此基础上进一步探讨了TSA增强CRC细胞株Lovo对5-Fu化疗敏感性，并且探讨了部分可能的机制，为CRC的临床治疗提供了新的思路，但TSA是否还通过其他机制提高5-Fu的化疗敏感性尚待进一步研究。
利益冲突 无
