观察研制的一种由纳米铁颗粒制备的药物在体外磁场作用下对荷瘤小鼠肿瘤的治疗作用。
应用自组装、超声乳化法将纳米铁及多柔比星（DOX）包裹于聚乳酸／乙醇酸共聚物（PLGA）（Fe3O4-PLGA-DOX）中，将其注射入Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤内，加体外磁场，观察其对小鼠肿瘤的杀伤作用。小鼠死亡后观察主要脏器的病理组织学，通过铁染色观察纳米铁在各脏器中的存留。
成功制成Fe3O4-PLGA-DOX，其具有磁性，可以缓释药物。在体外磁场作用下Fe3O4-PLGA-DOX对肿瘤细胞的杀伤作用较单用DOX更强，Fe3O4-PLGA-DOX加体外磁场组肿瘤平均体积（1.027±0.606) cm3，单用DOX组肿瘤平均体积（1.698±0.971) cm3，Fe3O4-PLGA-DOX未加磁场组肿瘤平均体积（1.911±1.003) cm3。Fe3O4-PLGA-DOX加用磁场治疗的小鼠转移率降低，纳米铁大量存留于肿瘤细胞中，未被各主要脏器摄取。
Fe3O4-PLGA-DOX是一种新型药物，加用外磁场后，具有增强杀伤肿瘤细胞的作用，实现了物理靶向治疗肿瘤。
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肿瘤在我国及世界的发病率一直上升，其病死率在我国已跃居第一位。目前治疗的方法，特别是化学药物治疗尚存在药物全身分布而不能浓集到肿瘤区、毒副作用大的问题。为使药物浓集于肿瘤区，目前已有生物靶向药物，即应用单克隆抗体或蛋白肽等连接药物、靶向肿瘤相对特异抗原，或高表达的受体，使化疗效果有了改进[1,2]，但仍有待提高。近年来兴起了纳米药物治疗肿瘤的新技术，由于纳米颗粒微小，其直径小于100 nm，因而能穿透细胞膜及核膜，使药物更多地进入肿瘤细胞，达到杀伤肿瘤细胞的作用，从而降低了有效给药剂量，减少了药物毒副作用。此外，它还具有改变细胞膜通透性而降低或逆转化疗药物多药耐药性的作用[3]。纳米铁是纳米药物的一种，已应用于临床肿瘤治疗，大多为通过热疗而杀伤肿瘤细胞，有的连接化疗药物；纳米铁也被认为是比较安全的药物[4,5,6,7,8,9,10]。此外，基于纳米铁的磁性，可应用体外磁场将纳米铁吸附到肿瘤区，起到物理靶向的作用[11,12]，这对一些表浅或四肢的肿瘤更为适合。然而，要达到较好的靶向治疗效果，还有很多问题待研究，如纳米铁的理化性质、给药途径、体外磁场的应用方案等。本研究为探索这些问题进行了初步探讨。
采用超声乳化自行组装法制备。首先配制PLGA；其次，四氧化三铁（Fe3O4）由二铁盐FeCl2·4H2O 0.86 g及三铁盐FeCl3·6H2O 2.35 g共沉淀法制成。DOX购自浙江海正药业公司，采用水包油（oil-in-water，O/W）乳化蒸发技术制备Fe3O4-PLGA-DOX：(1）制备表面包覆油酸的Fe3O4磁性纳米颗粒；（2）DOX溶于二氯甲烷；（3) PLGA溶于二氯甲烷溶液，将上述Fe3O4及DOX加入PLGA中；(4）将上述混合液滴加到表面活性剂Pluronic F127水溶液中，0℃下超声乳化，室温振荡以挥发二氯甲烷，最后4℃，19 000×g离心5 min，收集载药磁性复合纳米材料。
Fe3O4-PLGA-DOX的理化特性观察：用透射电子显微镜及光动力扫描仪检测纳米铁的形态及大小，应用紫外分光光度计检测DOX的释放。
小鼠Lewis肺癌（LLC）细胞由美国斯坦福大学宗康拉教授提供，细胞培养于含10％小牛血清DMEM培养液中，加100 U/ml青霉素及链霉素，在37 ℃、5 % CO2培养箱中培养。
雌性小鼠60只，6~ 8周龄，购于军事医学科学院，按照该院发布的饲养规则饲养。按简单随机法分为6组，每组10只，将含5×105 LLC细胞的0.5 ml PBS，注射于小鼠后背部皮下，当肿瘤长至约5 mm× 5 mm × 4 mm时，开始分组给药。（1）Fe3O4-PLGA-DOX加体外磁场组：DOX为200 μg （10 mg/kg）；（2）Fe3O4-PLGA-DOX不加体外磁场组：DOX为200 μg；（3）载体Fe3O4-PLGA加体外磁场组：载体Fe3O4-PLGA 165 mg/kg ；（4）载体Fe3O4-PLGA不加体外磁场组：载体Fe3O4-PLGA 165 mg/kg; (5）DOX 200 μg组；（6）对照组：0.9 % NaCl溶液组。上述所有药物均溶于0.9 % NaCl溶液，均为瘤内注射，加体外磁场组的小鼠在给药后，立即加外磁场。给药后每3 d用最小刻度为0.1 mm的量尺测量肿瘤大小，共14 d，为观察存活期。实验终止于给药后第37天。
外磁场为一圆形小磁片（图1），磁场强度为0.3 T，用胶条将小磁片固定于肿瘤区，作用48 h后将磁片去除。
小鼠死亡后，立即取出肿瘤、心、肝、脾、肺、肾组织，固定于4％甲醛溶液，石蜡包埋切片，除HE染色外，应用普鲁士蓝染色观察铁颗粒的分布。为判断肿瘤转移的情况，在显微镜中倍（×200）视野下观察，瘤灶占据1/3以上视野为"大" ，占据1/8~ 1/4视野为"中" ，占据小于1/10视野为"小" 。
应用SPSS 13.0软件处理结果，计量资料表示为均数±标准差（
±s），多组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
电子显微镜观察Fe3O4为4~6 nm微小颗粒（图2），应用自行组装法获得的三位一体药物Fe3O4 -PLGA-DOX，即铁及DOX包裹于PLGA，包裹后粒径为300~ 400 nm，平均380 nm（图3）。
2A ：Fe3O4颗粒；2B：Fe3O4-PLGA-DOX
颗粒直径范围为300~400 nm
Fe3O4-PLGA-DOX易溶于水，分散性好，在容器中可被外磁场吸附，表明包裹后保留了磁性（图4）。纳米铁被包裹率为90 %。
4A: Fe3O4-PLGA-DOX均匀悬浮于液体中及被外磁场吸附；4B：Fe3O4 -PLGA包裹DOX前后的颜色变化
DOX从PLGA中可逐渐释放。在pH值7.4和pH值5.0环境中均能缓慢释放7 d以上，在酸性环境中释放更快，达到的浓度峰值更高（图5），其原因可能为PLGA在酸性环境中降解较快以及DOX的氨基发生质子化。
各组肿瘤体积的变化见图6，在给药后第14天肿瘤的平均体积分别为：对照组（2.311±1.482）cm3 ，Fe3O4-PLGA-DOX加体外磁场组（1.027±0.606 ）cm3，Fe3O4-PLGA-DOX不加体外磁场组（1.911 ± 1.003） cm3，DOX 200 μg组（1.698±0.971) cm3，载体Fe3O4-PLGA加体外磁场组（2.212±0.875）cm3，载体Fe3O4-PLGA不加体外磁场组（2.295±0.904）cm3。从生长曲线看，14 d内，经Fe3O4-PLGA-DOX加体外磁场及不加磁场、单纯DOX处理后对肿瘤生长均有一定抑制作用，但仅Fe3O4-PLGA-DOX加体外磁场组与对照组差异有统计学意义（F=5.79，P=0.027）。14 d后，由于没有继续给药，各组肿瘤均继续生长，小鼠在给药后37 d内陆续死亡，平均生存时间为：Fe3O4-PLGA-DOX加体外磁场组（31.0 ± 5.0) d，Fe3O4 -PLGA-DOX不加体外磁场组（29.5 ± 7.5) d，DOX 200 μg组（31.0±6.0）d，对照组（24.5±4.5) d，各组生存期差异无统计学意义（F=2.49 ，P=0.076 ）。
Mag：体外磁场
在治疗期间，各组小鼠体质量未见降低，而且持续增加（图7），生活行为、精神状态、食欲等均无异常。
Mag：体外磁场
各组小鼠的主要器官，包括心、肝、脾、肺、肾均无明显病变，但有肿瘤转移至肺、肾、肝、脾及心脏。转移率在对照组最高，在Fe3O4-PLGA-DOX加体外磁场组最低（表1）。
聚乙酸／乙醇酸共聚物包裹的四氧化三铁（Fe3O4）及多柔比星（DOX）颗粒Fe3O4-PLGA-DOX治疗后荷肺癌小鼠转移情况
聚乙酸／乙醇酸共聚物包裹的四氧化三铁（Fe3O4）及多柔比星（DOX）颗粒Fe3O4-PLGA-DOX治疗后荷肺癌小鼠转移情况
| 治疗分组 | 小鼠（只） | 肺转移（只） | 肾转移（只） | 肝转移小瘤灶（只） | 心脏转移中瘤灶（只） | 转移率[%（只）] | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 大 | 中 | 小 | 大 | 小 | |||||
| 空白对照组 | 8 | 4 | 2 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 87.5 (7 ) |
| DOX | 9 | 2 | 1 | 1 | 3 | 1 | 0 | 0 | 66.7 (6 ) |
| Fe3O4-PLGA-DOX | 10 | 2 | 2 | 2 | 1 | 0 | 1 | 0 | 60.0(6) |
| Fe3O4-PLGA-DOX-Mag | 8 | 2 | 0 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 50.0(4) |
| Fe3O4-PLGA | 7 | 3 | 2 | 1 | 2 | 0 | 0 | 0 | 85.7 (6) |
| Fe3O4-PLGA-Mag | 6 | 1 | 1 | 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 66.7 (4) |
注：Mag为体外磁场
经普鲁士蓝染色观察，在Fe3O4-PLGA-DOX加与不加体外磁场组及Fe3O4-PLGA加与不加磁场组均见铁颗粒沉积于肿瘤细胞内，并可见肺内转移的肿瘤细胞也有铁颗粒沉积；对照组及单纯DOX组未见铁颗粒（图8）。Fe3O4-PLGA-DOX加体外磁场组铁颗粒在肿瘤细胞中的沉积明显多于未加磁场组（图8）。此外，在不加外磁场组中，还可见铁颗粒沉积在肾曲管上皮细胞内，其中Fe3O4-PLGA组1只，Fe3O4-PLGA-DOX组1只（图9），而加外磁场组均未见铁颗粒在其他脏器沉积，也未见铁颗粒被肝及脾的网织内皮细胞吞噬。
8A、8C、8E为HE染色，8B、8D、8F为普鲁士蓝染色；8A、8B为Fe3O4-PLGA-DOX加体外磁场；8C、8D为Fe3O4-PLGA-DOX不加体外磁场；8E、8F为肺内转移的肿瘤细胞内纳米铁颗粒
我们设计制备的Fe3O4-PLGA-DOX是集靶向、缓释和治疗药物于一身的新药，在体外，验证了它具有磁性，DOX包裹率高，可从PLGA中缓释，可通过纳米材料增强杀伤肿瘤细胞作用及克服肿瘤细胞对化疗药物泵出的多药耐药问题。本研究表明应用体外磁场，磁性靶向可进一步提高其靶向性和治疗效果，从而实现对肿瘤的高效、低毒治疗。
文献[13, 14]报道高能的体外磁场可将携带铁的药物吸引到肿瘤区。本实验结果表明体外磁场的应用确实能增强纳米铁颗粒在肿瘤区的沉积。由于携带纳米铁的药物沉积增多，因而进一步增强了药物抑制肿瘤生长的作用，而且降低了肿瘤的转移。本实验中单用DOX一次给药时，未能明显减低肿瘤细胞的生长，与文献[14, 15]报道的DOX必须多次给药后才能有效的结果一致，表明只有加用体外磁场后才能有效降低肿瘤的生长。
体外磁场的强度及应用时间是一个关键而复杂的问题，一般认为需要足够的场强，且磁场应用的时间应与用药时间相一致，在小鼠的实验中，一些研究应用场强1.7 ～1.0 T作用30~ 60 min，达到了50%～90％肿瘤完全消退，而且小鼠生命延长[13,14,15]。我们应用的外磁场只有0.3 T，但应用了48 h，这是基于DOX从PLGA中的释放率在48 h时为50 %；结果没有达到肿瘤的完全消退，也未能延长小鼠的生存期，其是否是因为所用的磁场强度不够还有待进一步证实。应用磁场强度的大小受多种因素的影响，例如纳米铁的理化性质，磁场的强度与几何分布，靶向组织的深度，血管分布与血流速度等等，根据这些因素计算出适当的场强还有大量的工作待做。
本研究还发现Fe3O4-PLGA-DOX瘤内注射后，纳米铁未沉积在体内任何器官，包括肝、脾的网织内皮系统，这与经血循环动脉给药不同，后者仍有被网织内皮系统吞噬的现象[16]。除给药途径不同外，推测主要与本研究制作的纳米药物颗粒较大有关，Fe3O4-PLGA-DOX平均粒径为380 nm，当注射到瘤内后，不易经瘤区的微血管再回流进入血循环，我们也曾制备另一种纳米铁药物，即DOX连接于右旋糖酐（Fe3O4-Dex-DOX），其粒径平均为55 nm，同样瘤内注射并加外磁场，但纳米铁颗粒大量被网织内皮细胞吞噬，药物又回流进入血循环，提示药物颗粒的尺寸大于肿瘤血管的直径可能更好。
本研究还发现未用体外磁场时，纳米铁沉积于肾曲管上皮细胞，这与文献报道铁在体内代谢排出的途径是相同的[17]。而应用体外磁场后，未发现纳米铁沉积于肾曲管上皮细胞，这是否因体外磁场的作用将更多的铁颗粒富集于肿瘤细胞内，从而减缓了铁的代谢排出，降低了在肾曲管的沉积量而未能检出，还有待用更精确的方法检测。
此外，本研究应用Fe3O4-PLGA-DOX及体外磁场后，小鼠生活正常，体质量不减反而增加，解剖后各主要脏器无异常，初步表明其无明显毒副作用，是安全的。总之，本研究为肿瘤的靶向治疗提供了有前景的新疗法。
利益冲突 无
