研究多巴酚丁胺对顺铂（DDP）作用下人肺腺癌细胞株A549生物学行为及YAP和磷酸化YAP（P-YAP）蛋白表达的影响。
体外培养人肺腺癌细胞株A549，实验分为对照组、多巴酚丁胺组、DDP组和多巴酚丁胺与DDP联合组。用CCK-8法检测各组细胞的增殖抑制率，Transwell法和划痕愈合实验检测各组细胞的体外侵袭能力和迁移能力，流式细胞术检测各组细胞凋亡率，Western blot法检测各组细胞YAP和P-YAP蛋白的表达。
多巴酚丁胺或DDP能够抑制A549细胞增殖，呈浓度和时间依赖性（P<0.05）。对照组、多巴酚丁胺组、DDP组及多巴酚丁胺与DDP联合组的划痕愈合率分别为（41.22±0.70）%、（16. 11±0.39）%、（14.49±0.25）%、（7.24±0.30）%，差异有统计学意义（P<0.05）；穿膜细胞数分别为（262.91±2.81）、（115.03±4.26）、（81.88±3.91）、（48.51±3.99）个，差异有统计学意义（P<0.05）；凋亡率分别为（22.28±0.61）%、（27.92±1.36）%、（32.16±1.80）%、（36.70±1.87）%，差异有统计学意义（P<0.05）。与多巴酚丁胺组相比，多巴酚丁胺与DDP联合作用能够抑制YAP的表达及促进P-YAP的表达（P<0.05）。
多巴酚丁胺可能通过抑制YAP的表达来增强DDP的作用，进而抑制人肺腺癌A549细胞增殖、体外侵袭能力，并促进细胞凋亡。
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肺癌是恶性肿瘤患者死亡主要原因之一[1]，非小细胞肺癌（NSCLC）占全部肺癌的80%，虽然治疗已取得一定进步，但患者5年生存率仍在15%以下[2]。研究表明传统的治疗已经遇到了瓶颈，寻找新的肿瘤治疗靶点、发现新的药物是当今研究重点。Hippo信号通路最先在果蝇中被发现，在哺乳动物中高度保守，可调控细胞生长和凋亡。YAP是Hippo通路的核效应因子，正常情况流向细胞质[3,4]，当Hippo通路失活时，YAP会留在细胞核中，导致组织过度生长和肿瘤发生[5]。最近越来越多的证据表明YAP可能是一个候选致癌基因[6]，YAP在肺癌细胞核中含量增加，在肺癌组织中过表达，且YAP的过表达与NSCLC进展和不良预后密切相关[7]。YAP的致癌作用也在肺癌小鼠模型中得到验证，用多西环素诱导YAP持续活化可使小鼠肺癌进展，抑制YAP的表达可以减缓肺癌在小鼠体内的转移[8]。多巴酚丁胺是一种β肾上腺素受体激动剂，它可以通过抑制YAP的细胞核聚集而减少依赖YAP的基因转录，有望用于癌症治疗[9]。已有研究表明多巴酚丁胺可抑制人胃腺癌细胞的生长[10]。本研究将多巴酚丁胺与顺铂（DDP）单独或联合作用于人肺腺癌细胞株A549，观察其对细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡的影响，并探讨YAP和磷酸化YAP（P-YAP）蛋白的表达，寻找新的治疗肺癌药物。
人肺腺癌细胞株A549由山西医科大学生化实验室馈赠。F12K液体培养液和CCK-8试剂盒（武汉博士德公司），胰酶和胎牛血清（美国HyClone公司），多巴酚丁胺（上海第一生化药业有限公司），DDP（江苏豪森药业股份有限公司），二甲基亚砜（上海BBI生命科学有限公司），Transwell试剂盒（美国Corning公司），兔抗人YAP多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），兔抗人P-YAP多克隆抗体（美国Cell Signaling公司），辣根酶标记山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金桥生物工程公司）。
将A549细胞株在含10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素双抗的F12K培养液中培养，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中。每12 h换细胞培养液1次，待细胞长到培养瓶的80%左右时进行传代和冻存。
将A549细胞消化并制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×104/ml，加入96孔板，每孔100 μl，每组设5个复孔，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后弃上清，加入含多巴酚丁胺（0、7.5、15、30、60、120 μmol/L）、DDP（0、1.25、2.5、5、10、20 μg/ml）的培养液，并设置调零组，继续培养12、48、72 h，加入10 μl/孔CCK-8，置于细胞培养箱中1 h，在酶标仪480 nm处测定吸光度（A）值，计算各组细胞的增殖抑制率，绘制生长曲线。实验重复3次。
生长抑制率=[1-（加药组A值-调零组A值）/（阴性对照组A值-调零组A值）]×100%
将A549细胞消化后制成单细胞悬液接种于6孔板，细胞融合度达到90%以上时，用枪头划痕，用PBS洗去划落的细胞，分别加入含60 μmol/L多巴酚丁胺、5 μg/ml DDP和60 μmol/L多巴酚丁胺+ 5 μg/ml DDP的F12K培养液于6孔板中，对照组仅加入F12K培养液，于划痕后0、24 h对细胞进行观察拍照，图片采用Image J软件检测划痕面积，计算划痕愈合率。实验重复3次。
划痕愈合率=（1-各时间点划痕面积/初始划痕面积）×100%
将A549细胞分别用60 μmol/L多巴酚丁胺、5 μg/ml DDP和60 μmol/L多巴酚丁胺+5 μg/ml DDP处理48 h，消化离心调整细胞密度为5×108/L，每组取100 μl接种到Transwell板的上室，下室加入600 μl含20%胎牛血清的培养液，每组设3个复孔，在培养箱中继续培养，48 h后取出上室，用棉棒拭去上层细胞，4%的多聚甲醛溶液固定后用苏木精染色，PBS洗涤2次，在倒置显微镜下观察细胞的侵袭情况，随机选出10个视野（×200）进行计数，取平均值进行统计学分析。实验重复3次。
侵袭抑制率=（1-处理组平均侵袭细胞数/对照组平均侵袭细胞数）×100%
将对数生长期的A549细胞消化后分别接种于6孔板中，培养12 h，细胞贴壁后分成4组处理，即阴性对照组（PBS）、多巴酚丁胺组（60 μmol/L多巴酚丁胺）、DDP组（5 μg/ml DDP）和联合组（60 μmol/L多巴酚丁胺+5 μg/ml DDP），作用48 h后收集各组细胞。按照Annexin V-PI细胞凋亡检测试剂盒说明操作，用1×binding buffer调整细胞密度为1×105/ml，再加入5 μl Annexin V和5 μl PI混匀后避光培养20 min，加入400 μl 1×binding buffer，用流式细胞仪进行检测。实验重复3次。
将对数生长期的A549细胞分成4组处理，即阴性对照组（PBS）、多巴酚丁胺组（60 μmol/L多巴酚丁胺）、DDP组（5 μg/ml DDP）和联合组（60 μmol/L多巴酚丁胺+5 μg/ml DDP），作用48 h后收集各组细胞。提取各组细胞总蛋白并测定浓度。采用12%的SDS-PAGE电泳，电泳结束后转膜，5% BSA封闭后分别加入YAP、P-YAP和内参GAPDH相关一抗（1∶1 000），4 ℃过夜后，加入二抗（1∶5 000），室温反应2 h后，显影、曝光拍照，扫描显影条带图像并存入图像分析系统，应用Image J图像分析系统计算各样本条带灰度值，蛋白相对表达量以YAP或P-YAP灰度值与GAPDH灰度值的比值计算，实验重复3次。
采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料符合正态分布，用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
CCK-8法检测结果显示，不同浓度多巴酚丁胺（7.5~120 μmol/L）或DDP（1.25~40 μg/ml）作用24、48、72 h后可抑制A549细胞的增殖，细胞增殖抑制率增加，呈浓度和时间依赖性（图1）。本实验选择药物单独作用细胞生长抑制率在20%~30%之间的药物浓度作为后续实验的用药浓度。在60 μmol/L多巴酚丁胺作用48 h时，A549细胞的增殖抑制率为（29.51±1.74）%；在5 μg/ml DDP作用48 h时，A549细胞生长抑制率为（27.37±2.06）%。因此后续实验多巴酚丁胺和DDP浓度的分别为60 μmol/L和5 μg/ml。
a多巴酚丁胺7.5 μmol/L，b多巴酚丁胺15 μmol/L；c顺铂1.25 μg/ml，d顺铂2.5 μg/ml
划痕24 h后，阴性对照组、多巴酚丁胺组、DDP组和联合组A549细胞的划痕愈合率分别为（41.22±0.70）%、（16.11±0.39）%、（14.49±0.25）%、（7.24±0.30）%（F=3 368.81，P<0.05）。与阴性对照组相比，多巴酚丁胺组的愈合率降低（t=54.72，P<0.05）；与多巴酚丁胺或DDP单独用药组相比，联合组细胞划痕愈合率降低，差异有统计学意义（t=31.49，P<0.05；t=32.42，P<0.05）（图2）。Transwell实验显示阴性对照组、多巴酚丁胺组、DDP组和联合组A549细胞的穿膜细胞数分别为（262.91±2.81）、（115.03±4.26）、（81.88±3.91）、（48.51±3.99）个（F=1 872.68，P<0.05）。与阴性对照组相比，多巴酚丁胺组的穿膜细胞数明显减少（t=50.18，P<0.05）；与多巴酚丁胺或DDP单独用药组相比，联合组细胞穿膜数减少，差异有统计学意义（t=19.74，P<0.05；t=10.35，P<0.05）（图3）。
2A：阴性对照组0 h；2B：阴性对照组24 h；2C：多巴酚丁胺组24 h；2D：顺铂组24 h；2E：多巴酚丁胺与顺铂联合组24 h
3A：阴性对照组；3B：多巴酚丁胺组；3C：顺铂组；3D：多巴酚丁胺与顺铂联合组
流式细胞术检测结果显示，阴性对照组、多巴酚丁胺组、DDP组和联合组A549细胞的凋亡率分别为（22.28±0.61）%、（27.92±1.36）%、（32.16± 1.80）%、（36.70±1.87）%（F=50.52，P<0.05）。与阴性对照组相比，60 μmol/L多巴酚丁胺和5 μg/ml DDP单独作用于A549细胞时，均能促进细胞凋亡（t=6.52，P<0.05；t=8.98，P<0.05）；而多巴酚丁胺和DDP联合作用时，促进细胞凋亡的作用更显著，高于单独作用组（t=6.59，P<0.05；t=3.04，P<0.05）（图4）。
4A：阴性对照组；4B：多巴酚丁胺组；4C：顺铂组；4D：多巴酚丁胺与顺铂联合组
Western blot结果显示，阴性对照组、多巴酚丁胺组、DDP组和联合组A549细胞YAP的相对表达量分别为1.62±0.53、0.65±0.23、0.20±0.16、0.13±0.08（F=15.44，P<0.05）；P-YAP的相对表达量分别为0.09±0.05、0.37±0.15、0.38±0.17、1.17±0.31（F=17.07，P<0.05）。与阴性对照组相比，多巴酚丁胺和DDP单独作用后，均可使A549细胞YAP的表达降低（t=2.92，P<0.05；t=4.42，P<0.05），P-YAP的表达升高（t=3.01，P<0.05；t=2.88，P<0.05）；而多巴酚丁胺与DDP联合作用时，YAP表达低于多巴酚丁胺组（t=3.71，P<0.05），与DDP组差异无统计学意义（P>0.05），而P-YAP表达均高于多巴酚丁胺组和DDP组（t=4.01，P<0.05；t=3.83，P<0.05）（图5）。
1：阴性对照组；2：多巴酚丁胺组；3：顺铂组；4：多巴酚丁胺与顺铂联合组
目前肺腺癌已经取代鳞状细胞癌成为最常见的肺癌类型，女性比男性更易患肺腺癌[11]。DDP是目前广泛使用并且有效的化疗药物，其主要作用于DNA，诱导细胞凋亡，但临床上患者易对其形成耐药性，制约了其治疗效果[12]。因此寻找新的抗肿瘤耐药性的作用靶点已成为当今研究的重点。
Hippo通路调控细胞增殖和死亡[13]。哺乳动物Hippo通路由MST激酶（MST-1和MST-2）和LATS激酶（LATS-1和LATS-2）组成。正常情况下，Hippo通路被激活，MST激酶磷酸化LATS激酶，后者又使转录共激活因子YAP激活[4,14]，当YAP磷酸化后，从细胞核转移到细胞质中，P-YAP与细胞质中的14-3-3蛋白结合，随后被泛素化和降解，YAP依赖的基因转录关闭[15]。YAP调控细胞促进增殖和抑制凋亡基因的转录，Hippo通路通过这种级联磷酸化反应调节YAP的活性，阻止细胞增殖并诱导凋亡，当Hippo通路被破坏时，YAP就停留在细胞核中，导致组织过度生长，并引起肿瘤发生，因此YAP的细胞核定位可以决定细胞在发展和疾病中的命运[5,16]。在多种肿瘤（大肠癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌和肺癌等）中发现有YAP的高表达，并且和患者预后差相关[6,17]。YAP不直接和DNA结合，主要和TEAD结合，一起发挥转录共激活因子的作用，而TEAD有一个DNA结合结构域，调控目的基因的表达，引起细胞增殖[18]。
近年研究发现G蛋白偶联受体（GPCR）信号可调控Hippo通路[19]。多巴酚丁胺是G蛋白偶联β肾上腺素能受体的一个激动剂，主要用于治疗充血性心力衰竭和低心输出量。在人骨肉瘤细胞中发现多巴酚丁胺通过β肾上腺素受体调控其对YAP的作用，可以抑制YAP介导的TEAD报告基因的活性[9]。因此本研究采用多巴酚丁胺和DDP单独或联合作用于人肺腺癌A549细胞，CCK-8检测结果显示，多巴酚丁胺在体外对A549细胞的增殖起抑制作用；划痕愈合实验表明，当多巴酚丁胺和DDP单独作用于A549细胞时，细胞的迁移能力均降低，当二者联合作用时，细胞的迁移能力降低更明显，提示多巴酚丁胺和DDP对降低细胞的迁移能力有协同作用。肺癌细胞的侵袭转移是肺癌恶性的生物指标，也是肺癌患者治疗失败和死亡的主要原因[20]。本研究通过Transwell侵袭实验发现，人肺腺癌A549细胞在体外具有较强的侵袭能力，而当多巴酚丁胺和DDP分别作用于A549细胞时，侵袭能力均受到抑制，二者联合作用时，侵袭抑制能力高于单独作用组，提示多巴酚丁胺和DDP对抑制细胞体外侵袭有协同作用，多巴酚丁胺可能降低细胞对DDP的耐药性。流式细胞术检测结果显示，多巴酚丁胺和DDP分别作用于A549细胞时，细胞的凋亡率升高；二者联合作用时，细胞凋亡率升高更明显，由此可见，多巴酚丁胺和DDP联合能明显提高DDP对人肺腺癌A549细胞的杀伤作用。
本研究中Western blot结果显示，YAP在人肺腺癌A549细胞中高表达，P-YAP表达量很低，而当多巴酚丁胺和DDP单独作用于A549细胞后，YAP的表达减少，P-YAP的表达增加，当二者联合作用时，A549细胞YAP的表达较多巴酚丁胺单独作用时减少，P-YAP的表达增加，提示多巴酚丁胺和DDP联合作用对增加P-YAP的表达并减少YAP的表达有协同作用。最近有研究显示，β肾上腺素受体的刺激可以显著诱导老鼠心脏PI3K-Akt通路[21]，而多巴酚丁胺可能促进Akt的磷酸化，Akt可使YAP Ser127磷酸化并使YAP转移到细胞质中[22]，YAP Ser127是YAP主要的磷酸化区域，并且决定YAP的亚细胞定位，因此多巴酚丁胺可能是通过促进Akt的磷酸化使YAP转化为P-YAP，从而抑制肿瘤的生长。多巴酚丁胺可能是通过减少YAP和TEAD结合，降低了它们作为转录共激活生长因子的作用，增强了DDP与肺癌细胞DNA的结合，从而协同DDP抑制肿瘤的生长。
研究发现越来越多的蛋白与Hippo信号通路相关联，由于YAP可以转移到细胞核中并激活目的基因表达，因此把YAP从细胞核中转移出来在理论上是最有效阻止YAP在细胞核中行为的方式。本实验找到了抑制依赖YAP基因转录的药物，为临床治疗提供了可能。
利益冲突 无
