探讨云南省宣威地区非小细胞肺癌（NSCLC）组织中石英沉积与核因子κB（NF-κB）的表达关系，评价石英沉积在宣威地区NSCLC致癌机制中的作用。
收集2009年7月至2015年9月昆明医科大学第三附属医院手术切除的NSCLC及良性（或炎性）病变肺组织标本。肺组织病理标本行透射电镜（TEM）观察，选区电子衍射（SAED）及X线能量色散分析（EDS），观测各组中石英沉积和局部病理变化。检测肺组织中NF-κB蛋白的表达，与沉积石英粒径行相关分析。
TEM结果显示宣威地区NSCLC组肺组织中的石英赋存率明显高于非宣威地区NSCLC组及良性病变组（P<0.01），其石英平均粒径为（226±120）nm×（237±163）nm，小于后两组中的赋存粒径（P<0.05）；宣威地区NSCLC组肺组织中NF-κB蛋白表达水平明显高于非宣威地区NSCLC组及良性病变组（P<0.01），其癌组织与正常肺组织中的表达水平差异无统计学意义（P>0.05）；样本肺组织中的石英粒径与NF-κB蛋白表达水平呈负相关趋势。
石英沉积在宣威地区NSCLC的致癌机制中发挥一定作用，粒径越小细胞毒性越大。
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云南省宣威地区是肺癌高发地区之一，其死亡率可高于周边地区15倍以上[1]。目前我国肺癌死亡率为61.0/10万，位居恶性肿瘤首位，呈上升趋势[1,2]。以往研究表明：宣威地区肺癌死亡率在晚二叠纪C1煤层烟煤出产区呈增加趋势；扫描电镜发现：以C1煤层烟煤为主要生活燃料的宣威地区，肺腺癌患者的肿瘤组织中，存在纳米级石英（nano-sized quartz，nanoquartz）[3,4]；与其他地区比较发现，该地区烟煤含有大量石英（quartz）颗粒[5]，推测晚二叠纪C1煤层烟煤燃烧，导致空气中石英颗粒悬浮，是宣威地区肺癌高发的因素之一。石英为二氧化硅（SiO2）晶体，可导致肺纤维化或肿瘤发生[6]。活性氧代谢产物（reactive oxygen species，ROS）可通过核因子κB（NF-κB）活化信号转导途径加重DNA过氧化损伤，促进细胞分化、增殖，是石英致癌的主要机制之一[7]。同时，NF-κB作为细胞生存信号转导通路中的主要调节因子，在非小细胞肺癌（NSCLC）和其他恶性肿瘤化疗耐药机制中存在作用[8,9]。以往研究仅对宣威地区NSCLC的部分病理肺组织进行电镜扫描，并着重研究了宣威地区不同烟煤类型和成分的比较[10]，因此很难进一步阐明宣威地区NSCLC高死亡率与潜在致癌物分子生物学上的联系。我们选择宣威地区及非宣威地区NSCLC患者手术后肺组织病理标本进行研究，观测肺组织中沉积石英粒径和局部病理变化，对照不同地区NSCLC肺组织中石英沉积与NF-κB表达的关系，评价石英在宣威地区肺癌高死亡率中的作用。
收集2009年7月至2015年9月昆明医科大学第三附属医院胸外科手术切除肺组织病理标本。纳入标准：宣威地区出生并在当地居住15年以上；病理确诊NSCLC；家庭以燃煤为主要生活燃料。排除标准：肺转移性恶性肿瘤；术前接受化放疗；矽肺、特发性肺纤维化、石棉沉着病等职业暴露史；合并慢性阻塞性肺疾病、急性肺损伤及哮喘、肺炎等炎性疾病。
根据患者地区来源，分为试验组：宣威地区NSCLC 33例，年龄33~68岁，鳞状细胞癌13例，腺癌20例。阳性对照组：非宣威地区NSCLC 16例，年龄为40~69岁，鳞状细胞癌5例，腺癌11例。阴性对照组为肺部良性病变（或炎性病变）30例，年龄为12~54岁，肺结核12例，肺错构瘤10例，慢性肺脓肿8例。每例取病变组织及正常肺组织。本研究经医院医学伦理委员会审查许可。
手术切除肺组织标本，大小0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm，以电镜下常规生物样本制备程序，取100~150 nm层厚超薄切片。JEM-100CXⅡ型透射电镜（TEM）（日本电子株式会社）观察三组中病变及正常肺组织超薄切片上肺间质、肺泡腔、上皮细胞超微结构，寻找外源性沉积颗粒物。对微区内所见颗粒行选区电子衍射（SAED）：平行四边形衍射花样为单晶体结构；同心圆状多晶环衍射花样为复合晶体结构。
对晶体颗粒行EDS分析明确构成元素：若以Si元素为主，可确定石英（SiO2晶体），有机生物样品富含C、O、N等元素，TEM承载生物样品的铜网、样品室铝基底座等均可致Cu、Al、Cr等波峰增高；另外，生物样品制备时Os和U与细胞成分结合，EDS可见增高波峰，分析中排除上述干扰元素。
TEM下测量SiO2晶体粒径的大小：
实际最大横径、最大长径（nm）=[实测最大横径、长径（mm）]/[1 000×电镜放大倍数]×109
采用SPSS 17.0统计软件，计量资料行单因素方差分析，两两比较采用SNK检验，SiO2晶体粒径与相应肺组织中NF-κB蛋白表达的相关性分析行Pearson直线相关分析。计数资料采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
试验组肺组织中沉积石英的平均粒径（226±120）nm×（237±163）nm；试验组病理组织中，TEM在样本上发现单晶体颗粒沉积在核膜边缘（图1），EDS分析显示除C元素外，Si为主要构成元素，确定为SiO2晶体（图2）；多晶体颗粒呈同心圆状多晶环衍射花样，EDS分析确定为SiO2多晶体结构，呈泥沙状、簇状集聚（图3A）。粒径>120 nm晶体多沉积在肺泡腔、肺间质，周围见间质纤维化，胶原纤维增生，排列紊乱（图3B）。
1A：TEM在试验组病理超薄切片上发现具有平行四边形衍射花样的单晶体结构；1B：晶体（箭头所示）沉积于细胞核边缘
X射线计数即强度值与元素含量有关
3A：SiO2复合晶体沉积及其电子衍射花样 ×80 000；3B：SiO2复合晶体沉积局部（箭头所示）病理改变 ×10 500
石英最小粒径10.0 nm×12.5 nm，以多晶体形式存在；粒径<120 nm的石英多沉积在胞质、细胞核内；在实验组肺组织中，纳米级SiO2晶体位于肺泡Ⅱ型上皮细胞核内，与核膜下染色质可发生接触（图4）。
4A：×175 000；4B：×13 500
阳性对照组不同肺组织中沉积石英平均粒径（210±133）nm×（415±274）nm；阳性对照组正常肺泡间隔内的超微结构（图5A）；SiO2晶体呈长针状，赋存在肺泡沉积在肺泡Ⅱ型上皮细胞胞质边缘，间质中见大量胶原纤维增生（图5B）。
5A：正常肺组织超微结构 ×3 300；5B：SiO2晶体沉积局部病理改变 ×10 500
阴性对照组不同肺组织中沉积石英平均粒径（249±104）nm×（514±276）nm；肺良性或炎性病灶组织肺泡结构消失，被大片无结构均质组织所填充，所见SiO2晶体沉积其中（图6）。
6A：SiO2晶体电子衍射结果；6B：SiO2晶体沉积区域病理改变透射电镜 ×135 00
试验组中的石英平均粒径均要小于阳性及阴性对照组（P<0.05）；但试验组肺组织中的石英赋存率明显高于阴性对照组和阳性对照组（P<0.01），对照组间比较差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。
三组SiO2晶体的赋存情况比较
三组SiO2晶体的赋存情况比较
| 组别 | TEM超薄切片样本数 | -（例） | +（例） | 阳性率（%） |
|---|---|---|---|---|
| 试验组 | 54 | 7 | 47 | 87.03 |
| 阳性对照组 | 32 | 22 | 10 | 31.25 |
| 阴性对照组 | 30 | 23 | 7 | 23.33 |
注：试验组为宣威地区非小细胞肺癌，阳性对照组为非宣威地区非小细胞肺癌，阴性对照组为肺部良性病变（或炎性病变）；TEM为透射电镜；三组阳性率总体比较χ2=51.125，P<0.01
试验组肺组织中，肿瘤组织与正常肺组织中NF-κB蛋白表达水平差异无统计学意义（F=4.47，P=0.178），但均明显高于阳性对照组及阴性对照组（F=19.88，P=0.000）（表2）。
核因子（NF）-κB蛋白在不同肺组织中表达（A值，
±s）
核因子（NF）-κB蛋白在不同肺组织中表达（A值，±s）
| 组别 | 样本数 | 病变组织中 | 正常肺组织 |
|---|---|---|---|
| 试验组 | 54 | 271±78 | 256±69 |
| 阳性对照组 | 32 | 188±41 | 137±57 |
| 阴性对照组 | 30 | 156±68 | 103±37 |
注：试验组为宣威地区非小细胞肺癌，阳性对照组为非宣威地区非小细胞肺癌，阴性对照组为肺部良性病变（或炎性病变）
分析发现三组不同肺组织，随着SiO2晶体粒径减小，样本中的蛋白表达水平有增加的趋势，二者呈负相关（r=-0.377，P<0.05）。
宣威地区是云南省主要产煤基地，以烟煤、无烟煤、木柴为生活燃料。烟尘排放导致了室内环境污染，肺癌在使用烟煤的人群中，占60岁以前死亡人群的40%；烟煤使用与肺癌死亡率的增加有关，男性危害比为38，其95%可信区间（CI）为20~65，女性危害比为99，其95% CI为37~266，故暴露于含苯并（A）芘为代表的多环芳烃类（PAH）和矿物质（特别是SiO2/石英）的烟煤污染环境是导致宣威地区肺癌高死亡率的主要危险因素[14,15]。但近年发现当地可开采烟煤集中在宣威地区晚二叠世C1煤层中，烟煤中有机挥发物（VOC）和石英含量分别较无烟煤中含量高出5~15倍和2倍以上（包括可吸入石英），石英部分为纳米级晶体（粒径<100 nm），但这一地区不同煤矿矿源，其烟煤中PAH和矿物元素组成（如石英）含量也存在不同[9]。所以，宣威地区NSCLC主要致癌因素还无法完全确定，石英致癌性的归因度尚不能用来完全解释其肺癌的高死亡率[9]。
空气中有害物质（含大量VOC）可形成悬浮细颗粒或气溶胶，吸入气道及肺泡腔，环境污染直接诱发癌变；但目前还没有研究报道肺组织中吸入性颗粒（潜在致癌物）的沉积及其病理改变情况；此外，宣威地区NSCLC中石英致癌性的分子生物学机制也需进一步阐明。
我们通过TEM观察，SAED及EDS分析进行石英颗粒物相鉴定，观察到SiO2晶体在宣威地区NSCLC组肺组织中的赋存率要明显高于对照组，粒径>120 nm晶体主要沉积在肺泡腔、肺间质内，周围组织内胶原纤维增生明显，排列紊乱，符合过氧化损伤后组织病理学变化。而<120 nm SiO2晶体粒径小，可透过细胞膜、胞质而进入核膜下，TEM多在细胞质、胞核内发现，可与核染色质直接接触，可能是其细胞毒性更强、发生DNA直接损伤的原因之一。
宣威地区NSCLC组肺组织中沉积SiO2晶体并非完全以纳米级晶体为主，这一现象可能是因为大体积颗粒容易沉积在肺间质、肺泡上皮细胞内，而纳米级颗粒可透过细胞膜或血管内皮细胞发生转移，容易被巨噬细胞吞噬、转运，不一定能长期在肺组织中沉积，产生严重细胞毒性损伤。人体肺三维容积对经呼吸道吸入的颗粒来说，是非常巨大的，宣威地区NSCLC组中的石英分布粒径要小于对照组，而NF-κB蛋白表达水平高于对照组，把所有肺组织标本进行比较，在SiO2晶体沉积区域，NF-κB蛋白表达水平与其晶体粒径呈负相关关系，说明石英过氧化损伤后细胞毒性随着SiO2晶体粒径的减小而增强。目前PAH室内污染环境、当地人口免疫基因遗传多态性[14]在宣威地区肺癌中的作用已被明确，可以肯定石英沉积在肺组织中，因DNA过氧化损伤在宣威地区NSCLC高发中也存在一定作用。
NF-κB可激活基因表达、mRNA转录、诱发炎性介质产生[16]，作为转录因子，它在调控细胞增殖，肺恶性肿瘤形成机制中具有重要作用[17]；试验组肺组织中NF-κB蛋白表达水平明显高于对照组，且癌组织与正常肺组织中的表达水平无明显差异，这与肺组织中的石英赋存率明显高于对照组的结果相一致；因而可以推测宣威地区与非宣威地区NSCLC致癌机制可能不同，由于SiO2晶体沉积及其他致癌因素作用，基因表达调控紊乱，导致NF-κB基因大量转录与蛋白活化，这与之前对肺组织中沉积无机物的研究发现激活NF-κB-iNOS信号通路可能促进了宣威地区肺癌发生的结论相符[18]。从而可为石英沉积→NF-κB活化信号转导途径加重DNA过氧化损伤→宣威地区肺癌高发假设提供初步依据，
我们观察到宣威地区NSCLC组肺组织中沉积SiO2晶体的平均粒径为225.78 nm×237.24 nm，提醒我们在今后宣威地区肺癌的研究中，不仅要注重纳米级SiO2晶体，也需考虑较大晶体的毒性作用。
利益冲突 无
