利用量子点免疫荧光成像技术，探讨黏蛋白1及Ⅳ型胶原蛋白与浸润性乳腺癌临床病理特征的关系。
应用量子点免疫荧光成像技术和免疫组织化学技术检测2007年7月至2010年7月桂林医学院附属医院收治的94例乳腺癌组织中黏蛋白1及Ⅳ型胶原蛋白的表达，分析黏蛋白1及Ⅳ型胶原蛋白定量参数与乳腺癌患者临床病理特征的相关性及其与预后的关系。
量子点免疫荧光成像技术和免疫组织化学技术标记人乳腺癌组织中黏蛋白1阳性率分别为73.4 %（69/94）、69.1 %（65/94），Ⅳ型胶原蛋白阳性率分别为53.2 %（50/94）、47.9 %（45/94），差异均无统计学意义（均P>0.05），两种方法标记的效果具有一致性（κ=0.763，P=0.000；κ=0.759，P=0.000）。分析量子点免疫荧光成像技术检测结果，黏蛋白1与Ⅳ型胶原蛋白的表达呈负相关（r=-0.883，P<0.01）；黏蛋白1和Ⅳ型胶原蛋白的表达与肿瘤大小（F=3.683，P=0.029；F=4.922，P=0.009）、组织学分级（F=3.529，P=0.033；F=3.912，P=0.023）、淋巴结转移（t=-4.868，P=0.000；t=3.868，P=0.000）、病理分期（t=-8.337，P=0.000；t=5.962，P=0.000）和5年无病生存率（均P=0.000）均有相关性。
利用量子点免疫荧光成像技术可同时检测黏蛋白1及Ⅳ型胶原蛋白，可为乳腺癌生物学行为及预后判断提供依据。
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黏蛋白1在肿瘤细胞表面广泛表达，与肿瘤细胞的生长、增殖分化、浸润转移、黏附及机体的免疫监控有关，已成为一种重要的肿瘤标志物[1]。以其为靶点的肿瘤早期诊断及免疫治疗是目前研究的热点。多项研究表明黏蛋白1促进肿瘤侵袭转移[2,3]，是肿瘤预后不良因素[4,5,6]，但目前仍缺乏直接的形态学证据。本研究运用量子点免疫荧光成像技术标记乳腺癌组织中黏蛋白1及Ⅳ型胶原蛋白，并进行定量分析，将乳腺癌细胞与细胞外基质的主要蛋白可视化，为探讨黏蛋白1及Ⅳ型胶原蛋白在乳腺癌生物学行为和预后判断中的作用提供依据。
收集桂林医学院附属医院2007年7月至2010年7月经手术切除的94例乳腺癌患者石蜡包埋组织及其详细的临床病理资料，患者均为女性，均经病理诊断为乳腺浸润性导管癌，中位年龄53岁（25~71岁）。术前均未行放化疗，至少有5年完整随访资料。
鼠抗人黏蛋白1单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司，兔抗人Ⅳ型胶原多克隆抗体购自英国Abcam公司，量子点QDs525标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）的抗原结合片段[F（ab'）2-QDs525]和量子点QDs585标记的山羊抗兔IgG的抗原结合片段量子点[F（ab'）2-QDs585]购自美国Invitrogen公司，生物素化羊抗鼠/兔二抗购自武汉珈源量子点公司，二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。
乳腺癌组织石蜡包埋切片，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。柠檬酸抗原修复液中微波进行抗原修复，冷却，洗涤。滴加2% BSA封闭，滴加一抗，37 ℃湿盒培养2 h转至4 ℃过夜，洗涤。滴加二抗，37 ℃培养45 min。DAB显色，苏木精对比染色，常规脱水，透明，干燥，封片。显微镜下观察并采集图像。黏蛋白1染色阳性结果的判定标准：染色强度分为0（阴性）、1（弱阳性）、2（中阳性）、3（强阳性）4个级别；阳性细胞率为0（<25%）、1（≥25%且<50%）、2（≥50%且<75%）、3（≥75%）4个级别；染色强度与阳性细胞率的得分相乘，结果判定为阴性（0分）、弱阳性（1~3分）、中-强阳性（4~9分）。雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）及人类表皮生长因子受体2（HER-2）均为原始切片染色，ER和PR阳性定义为肿瘤细胞核染色；HER-2阳性定义为30%肿瘤细胞呈细胞膜染色。
肿瘤组织经甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm厚切片，于60 ℃恒温烤箱中烤片1 h，常规二甲苯脱蜡（6 min×3次），梯度乙醇（100%、95%、95%、80%）脱苯，自来水冲洗，TBS洗涤（3 min×3次）；柠檬酸抗原修复液中微波修复（低火修复5 min后转至中火修复10 min），冷却，TBS洗涤（3 min×3次）；滴加2% BSA封闭，37 ℃培养30 min；滴加鼠抗人黏蛋白1单克隆抗体（1∶50稀释）、兔抗人Ⅳ型胶原多克隆抗体（1∶100稀释），对照组用TBS代替一抗。37 ℃湿盒培养2 h转至4 ℃过夜，TBST洗涤（3 min×3次）；滴加2% BSA封闭，37 ℃培养30 min；滴加二抗F（ab'）2-QDs525、F（ab'）2-QDs585（1∶100稀释），37 ℃湿盒培养2 h，TBST洗涤（2 min×2次）后再用TBS洗涤（3 min×1次）；90%甘油封固后，荧光显微镜下观察，紫外光激发（波长为330~385 nm）。黏蛋白1定位于细胞膜与细胞质，显示绿色信号；Ⅳ型胶原蛋白定位于基质，显示橙黄色信号，用Olympus BX51荧光显微镜进行图像采集。
Olympus BX51正置荧光显微镜在紫外光激发（波长330~385 nm）下应用CRi Nuance多光谱成像系统，对每个组织样本每隔10 nm波长进行光谱扫描，获得该样本的光谱数据库。根据CRi Nuance多光谱成像系统分析软件，剥离黏蛋白1或Ⅳ型胶原蛋白分子成像荧光，并对黏蛋白1或Ⅳ型胶原蛋白表达强度和分布范围同时进行量化评分，得到每个病例的量子点评分。
应用SPSS 19.0统计软件分析数据。两种染色方法的一致性分析和总体阳性率的比较分别采用Kappa检验和χ2检验；采用Spearman法进行相关分析；计量资料符合正态分布，采用均数±标准差（
±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验；采用受试者工作特征（ROC）曲线分析定义最佳界值点；采用Kaplan-Meier法分析患者无病生存情况，无病生存时间以手术日期至疾病进展或末次随访时间计算，采用Log-rank检验评估组间差异。以P<0.05为差异有统计学意义。
在连续组织切片相似视野下对IHC法与量子点免疫荧光成像的标记结果进行比较，两种方法标记黏蛋白1和Ⅳ型胶原蛋白的效果具有一致性（表1）。量子点免疫荧光成像标记黏蛋白1和Ⅳ型胶原蛋白的阳性率[73.4%（69/94）、53.2%（50/94）]均高于IHC法[69.1%（65/94）、47.9%（45/94）]，两种方法总体阳性率比较差异无统计学意义（χ2=2.286，P=0.515；χ2=4.000，P=0.261）（图1）。
免疫组织化学（IHC）与量子点免疫荧光成像技术标记乳腺癌黏蛋白1及Ⅳ型胶原蛋白结果一致性分析（例）
免疫组织化学（IHC）与量子点免疫荧光成像技术标记乳腺癌黏蛋白1及Ⅳ型胶原蛋白结果一致性分析（例）
| IHC检测 | 例数 | 量子点免疫荧光成像 | κ值 | P值 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 阴性 | 低表达 | 高表达 | |||||
| 黏蛋白1 | |||||||
| 阴性 | 11 | 9 | 1 | 1 | |||
| 弱阳性 | 18 | 1 | 12 | 5 | 0.763 | 0.000 | |
| 中-强阳性 | 65 | 0 | 2 | 63 | |||
| Ⅳ型胶原蛋白 | |||||||
| 阴性 | 23 | 18 | 2 | 3 | |||
| 弱阳性 | 26 | 1 | 21 | 4 | 0.795 | 0.000 | |
| 中-强阳性 | 45 | 0 | 2 | 43 | |||
经量子点免疫荧光成像技术检测显示，随着黏蛋白1表达增强，Ⅳ型胶原蛋白破坏亦加强，通过Spearman相关分析得出，黏蛋白1与Ⅳ型胶原蛋白呈负相关（r=-0.883，P<0.01）。
不同年龄、激素受体状态及HER-2状态的乳腺癌患者间，肿瘤组织中黏蛋白1和Ⅳ型胶原蛋白的表达差异均无统计学意义（均P>0.05）；与肿瘤直径≤5 cm、无淋巴结转移、病理分期Ⅰ~Ⅱ期比较，黏蛋白1在肿瘤直径>5 cm、有淋巴结转移、病理分期Ⅲ~Ⅳ期中高表达，量子点评分增高，而Ⅳ型胶原蛋白低表达，量子点评分低（均P<0.05）；且在不同组织学分级中，黏蛋白1和Ⅳ型胶原蛋白表达均差异有统计学意义（均P<0.05）（表2）。提示黏蛋白1和Ⅳ型胶原蛋白在乳腺癌中表达的异常可能与乳腺癌的侵袭转移有关。
不同临床病理特征乳腺癌患者黏蛋白1和Ⅳ型胶原蛋白的量子点免疫荧光成像标记评分结果（分，
±s）
不同临床病理特征乳腺癌患者黏蛋白1和Ⅳ型胶原蛋白的量子点免疫荧光成像标记评分结果（分，±s）
| 病理临床特征 | 例数 | 黏蛋白1 | 统计值 | P值 | Ⅳ型胶原蛋白 | 统计值 | P值 | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 年龄（岁） | ||||||||
| ≤50 | 51 | 88±20 | t=-0.627 | 0.532 | 73±19 | t=0.601 | 0.549 | |
| >50 | 43 | 90±20 | 71±22 | |||||
| 肿瘤直径（cm） | ||||||||
| ≤2 | 33 | 87±15 | F=3.683 | 0.029 | 76±15 | F=4.922 | 0.009 | |
| >2且≤5 | 55 | 88±22 | 73±22 | |||||
| >5 | 6 | 110±12 | 49±8 | |||||
| 激素受体状态 | ||||||||
| 阴性 | 30 | 86±18 | t=-0.835 | 0.406 | 74±21 | t=0.526 | 0.600 | |
| 阳性 | 64 | 90±21 | 71±20 | |||||
| HER-2状态 | ||||||||
| 阴性 | 52 | 90±21 | t=0.475 | 0.636 | 72±20 | t=0.181 | 0.857 | |
| 阳性 | 42 | 88±19 | 72±21 | |||||
| 组织学分级 | ||||||||
| Ⅰ | 7 | 83±8 | F=3.529 | 0.033 | 75±11 | F=3.912 | 0.023 | |
| Ⅱ | 69 | 92±19 | 69±19 | |||||
| Ⅲ | 18 | 79±22 | 83±25 | |||||
| 淋巴结转移 | ||||||||
| 有 | 44 | 99±22 | t=-4.868 | 0.000 | 64±20 | t=3.868 | 0.000 | |
| 无 | 50 | 81±14 | 79±17 | |||||
| 病理分期 | ||||||||
| Ⅰ～Ⅱ | 74 | 82±14 | t=-8.337 | 0.000 | 78±17 | t=5.962 | 0.000 | |
| Ⅲ～Ⅳ | 20 | 114±18 | 58±17 | |||||
注：HER-2为人类表皮生长因子受体2
黏蛋白1量子点评分预测5年无病生存的最佳临界值为90.5，其特异度和灵敏度分别为79.2%和60.9%，ROC曲线下面积（AUC）为0.75；Ⅳ型胶原蛋白量子点评分预测5年无病生存的最佳临界值为66.5，其特异度和灵敏度分别为65.2%和85.4%，AUC为0.768（图2）。根据最佳临界值将患者进行分组，黏蛋白1低表达（量子点评分≤90.5分）及Ⅳ型胶原蛋白高表达（量子点评分>66.5分）的患者5年无病生存率较黏蛋白1高表达（量子点评分>90.5分）及Ⅳ型胶原蛋白低表达（量子点评分≤66.5分）患者高（P<0.05），提示黏蛋白1低表达及Ⅳ型胶原蛋白高表达的患者预后好（图3）。
黏蛋白1是一种具有跨膜序列的高相对分子质量糖蛋白，主要表达于多种分泌性上皮细胞胞膜分泌极的顶端。其由黏蛋白1-N和黏蛋白1-C两个亚单位构成，其中黏蛋白1-N亚基包含数目不等的糖基化串联重复序列，而黏蛋白1-C亚基包括胞外段、跨膜区及胞质段，黏蛋白1-C通过胞质段的氧化磷酸化激活、介导细胞内的信号转导，在肿瘤发生发展中起到癌基因作用[1,3]。研究表明，黏蛋白1可降低细胞间的黏附性、增强细胞运动能力、促进细胞侵袭转移，是恶性肿瘤预后不良因素[7]。
包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤组织中，黏蛋白1表达增高，其表达水平与肿瘤分期、淋巴结转移、脉管浸润及侵袭转移等密切相关，是某些肿瘤的不良预后因素[4,6,8,9]。在细胞水平，黏蛋白1过表达可导致肿瘤细胞间的黏附性下降、运动力增强[7]，干扰黏蛋白1表达可使细胞增殖能力下降、与细胞外基质黏附能力增强、侵袭转移能力下降[10]。动物实验显示黏蛋白1阳性的裸鼠移植肿瘤更易侵及胃壁肌层，更易出现远处转移[11]；黏蛋白1缺失则肿瘤生长缓慢。其中具体的分子机制可能与其抑制宿主免疫反应、加速细胞外基质的降解、增强肿瘤细胞与内皮细胞的黏附性及加强细胞内外的信号转导等相关[1]。本研究结果显示，在乳腺癌患者中，黏蛋白1表达随病变进展而升高，而且与肿瘤大小、淋巴结转移数目、病理分期有关；黏蛋白1表达与无病生存期相关，可作为乳腺癌的预后不良因素。
侵袭转移是恶性肿瘤预后不良的重要原因，而细胞外基质降解破坏被认为是其中重要的环节。Ⅳ型胶原蛋白组成细胞外基质中基底膜的基本骨架，并能调控细胞间的黏附，是抑制肿瘤细胞侵袭转移的重要屏障之一[12]。恶性肿瘤细胞通过刺激基质金属蛋白酶（MMP）的分泌，特异性降解Ⅳ型胶原蛋白等细胞外基质，破坏基底膜的完整性，进而促进肿瘤细胞穿过基底膜实现侵袭转移[13]。肿瘤细胞的侵袭转移常表现为恶性肿瘤基底膜的缺失，癌巢周围的Ⅳ型胶原变细、断裂、不连续，随着肿瘤恶性程度的增加，Ⅳ型胶原蛋白缺失率增加[12,14]。本研究发现，Ⅳ型胶原蛋白表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、病理分期呈负相关。随着Ⅳ型胶原破坏、降解增加，肿瘤转移概率提高，同时显示预后不良。提示通过研究肿瘤细胞与Ⅳ型胶原的动态变化，可监测肿瘤的侵袭转移过程。
量子点与传统有机荧光相比具有独特的光学效应：激发光谱宽，连续分布，发射波长窄，呈对称分布；荧光产率高，强度高；抗光漂白能力强；荧光寿命长，其摩尔消光系数比普通有机荧光高出10~50倍[15,16]。因此，量子点免疫荧光成像技术可实现分子的原位、实时、定量、多组分、长时间成像，是研究肿瘤侵袭转移的有效技术手段[17,18]。近年来量子点被用于实时、动态研究肿瘤细胞与肿瘤微环境中多种成分的相互作用，通过对微环境中巨噬细胞（CD68）、Ⅳ型胶原蛋白、肿瘤新生血管标志物CD105及MMP-9的标记，直观地展示了肿瘤演进过程中肿瘤细胞与微环境的动态变化过程[19,20]。本研究利用量子点免疫荧光成像技术同时标记乳腺癌组织中黏蛋白1和Ⅳ型胶原蛋白，解决了传统IHC难以观察同一部位多种抗原共表达的难题，为实时监测乳腺癌细胞与细胞外基质间的相互作用提供了研究方向。我们进一步研究发现随着乳腺癌组织中黏蛋白1表达水平升高，Ⅳ型胶原蛋白荧光定量不断下降，两者表达水平之间呈负相关。形态学上观察到在乳腺癌不同分期中，黏蛋白1表达随病变进展细胞膜上免疫荧光逐渐变亮，癌巢周围的Ⅳ型胶原蛋白则出现变薄、凹陷、不完整、碎裂甚至缺失等一系列变化，在高表达黏蛋白1的组织中甚至显示出血管侵犯。这可能与黏蛋白1导致MMP-13表达上调、Ⅳ型胶原降解加速有关[21]。
我们利用量子点免疫荧光成像技术同时标记黏蛋白1和Ⅳ型胶原蛋白，不仅从形态学上呈现乳腺癌进展过程中黏蛋白1表达水平与Ⅳ型胶原蛋白降解程度的关系，而且还对这两者表达水平进行定量分析，为黏蛋白1及Ⅳ型胶原蛋白作为肿瘤标志物在乳腺癌生物学行为和预后判断中的作用提供直观的图像证据及客观的数据支持。
利益冲突 无
