Inhibitory effect of nigericin on human epithelial ovarian cancer cells and its mechanism

Wang Wen; Tian Xiangyu; Zhao Yan; Cui Xiujuan; Yao Shujuan; Zhang Shiqian

doi:10.3760/cma.j.issn.1006-9801.2018.09.005

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• 论著 •

尼日菌素对人上皮性卵巢癌细胞的抑制作用及其机制研究

肿瘤研究与临床, 2018,30(9) : 597-602,606. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1006-9801.2018.09.005

摘要

目的

探讨尼日菌素对人上皮性卵巢癌（EOC）A2780和SKOV3细胞的抑制作用，以及尼日菌素抑制细胞迁移和侵袭可能的分子机制。

方法

用不同浓度（0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L）尼日菌素分别作用于A2780和SKOV3细胞，二甲基亚砜（DMSO）处理细胞作为对照组，通过CCK-8法检测不同浓度的尼日菌素对EOC细胞增殖的影响。将A2780和SKOV3细胞分别分为3组：尼日菌素5、10、20 μmol/L处理组，同时以DMSO处理作为对照组，通过Transwell实验分析尼日菌素对EOC细胞迁移及侵袭能力的影响。采用蛋白质印迹法检测经不同浓度尼日菌素处理后上皮细胞-间充质细胞转化（EMT）过程中上皮细胞标志物E-cadherin、间叶细胞标志物Vimentin以及相关转录因子Slug、Snail和Twist的表达，并分析Wnt-β-catenin信号通路相关蛋白Gsk-3β、p-Gsk-3β和β-catenin的表达变化情况。

结果

CCK-8实验结果发现，尼日菌素对A2780细胞[半抑制浓度（IC₅₀）（16.19±0.26）μmol/L]和SKOV3细胞[IC₅₀（11.87±0.21）μmol/L]具有细胞毒性作用（P<0.05）。Transwell迁移实验结果显示，随着尼日菌素作用浓度（5、10、20 μmol/L）的增加，穿膜的A2780和SKOV3细胞数较对照组减少[（121±9）、（92±7）、（59±5）个/高倍视野和（120.4±2.6）、（91.8±5.5）、（80.0±4.0）个/高倍视野，均P<0.05]；Transwell侵袭实验显示，A2780和SKOV3细胞的侵袭能力同样随着尼日菌素作用浓度的增加而受到抑制，并呈浓度依赖性下降[（61.2±3.7）、（43.2±4.3）、（23.6±2.1）个/高倍视野和（85.2±7.0）、（65.2±4.6）、（45.6±4.4）个/高倍视野，均P<0.05]。E-cadherin的表达随着尼日菌素作用浓度（5、10、20 μmol/L）的增加而升高，而Vimentin、Slug、Snail、Twist、p-Gsk3β、β-catenin的表达呈浓度依赖性减少（P<0.05）。

结论

尼日菌素可能通过激活Wnt-β-catenin信号通路诱导EOC细胞发生EMT，从而促进EOC细胞的迁移和侵袭。

引用本文: 王稳, 田翔宇, 赵燕, 等. 尼日菌素对人上皮性卵巢癌细胞的抑制作用及其机制研究 [J] . 肿瘤研究与临床,2018,30 (9): 597-602,606. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1006-9801.2018.09.005

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上皮性卵巢癌（EOC）缺乏有效的早期筛查手段，发现时多已处于广泛盆腹腔转移的晚期，病死率高^[1]。目前对于晚期EOC的治疗较为棘手，铂类耐药是亟须解决的关键问题。尼日菌素是一种钾离子载体，属于一元酸抗生素，其可以通过抑制上皮细胞-间充质细胞转化（EMT）对乳腺癌、结直肠癌等肿瘤细胞发挥抑制作用，同时可以通过抑制EMT诱导间充质-上皮转化（MET），降低肿瘤细胞的侵袭、迁移能力。本研究分析尼日菌素对EOC细胞的抑制作用，以及尼日菌素抑制EOC细胞迁移和侵袭可能的分子机制，探讨尼日菌素在EOC转移治疗中的应用前景。

1　材料与方法

1.1　细胞及主要试剂

人EOC细胞株A2780购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，SKOV3购自美国典型物种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），尼日菌素购自美国Sigma公司，兔抗人E-cadherin、Vimentin、Slug、Snail、Twist、Gsk-3β、磷酸化Gsk-3β（p-Gsk-3β）、β-catenin单克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司，CCK-8试剂购自日本同仁化学研究所，Transwell小室（8 μm-pores）购自美国Corning公司。

1.2　细胞培养

A2780细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养，SKOV3细胞用含10%胎牛血清的McCoy's 5A培养液培养，细胞在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验。

1.3　CCK-8法检测细胞增殖

将接种A2780和SKOV3细胞的96孔板置于37 ℃、5% CO₂培养箱中常规培养24 h，提前配制好不同浓度（0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L）尼日菌素及0.1%终浓度二甲基亚砜（DMSO）（对照组）。分别加入各孔，每组均设5个复孔，培养48 h后取出培养板，在每孔中各加入10 μl CCK-8溶液，放入培养箱中继续培养2 h，用酶标仪测定450 nm波长处各孔的吸光度（A）值。按下式计算细胞活力。

细胞活力（%）=（A_尼日菌素-A_空白对照）/（A_阴性对照-A_空白对照）×100%

1.4　Transwell小室检测细胞迁移和侵袭

A2780和SKOV3细胞铺在6孔板中培养24 h后，将不同浓度（5、10、20 μmol/L）尼日菌素及DMSO（对照组）加入培养皿中培养48 h，每个浓度重复3次。利用Transwell小室模拟肿瘤细胞的迁移模型，迁移至Transwell小室下层的细胞用甲醇固定20 min后，0.1%结晶紫染色1 h，PBS冲洗20 min。将小室置于载玻片上，放置于显微镜下，随即于5个视野观察细胞，拍照并计数。将Matrigel基质胶铺于小室膜上层，模拟组织基质膜，其他操作同迁移实验，观察细胞的侵袭能力。

1.5　蛋白质印迹法检测相关蛋白的表达

A2780和SKOV3细胞铺在6孔板中培养24 h后，将不同浓度（5、10、20 μmol/L）尼日菌素及DMSO（对照组）加入培养皿中，细胞加药处理相应时间后，收集细胞，加入含有蛋白酶抑制剂cocktail以及磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液，按不同浓度分别提取细胞总蛋白。应用BCA定量法量取20 μg蛋白，置于10% SDS-PAGE凝胶电泳中分离，后转至PVDF膜中，用含0.1% Tween-20的5%脱脂牛奶室温摇床封闭1 h，4 ℃一抗反应过夜。取出PVDF膜后加入二抗，室温摇床反应1 h，室温下避光配制ECL发光液，加于PVDF膜上，暗室X线底片曝光。采用BCA法取20 μg蛋白确定蛋白浓度。

1.6　统计学方法

采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析，所有数据均为3次独立实验结果，计量资料符合正态分布，用均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　尼日菌素可以抑制A2780和SKOV3细胞增殖

CCK-8法检测结果显示，与对照组相比，尼日菌素可以抑制细胞增殖，细胞活力随作用浓度的增加而降低，各实验组与对照组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）（表1）。尼日菌素作用于A2780和SKOV3细胞的半抑制浓度（IC₅₀）分别为（16.19±0.26）μmol/L（95% CI 1.077~1.341）和（11.87±0.21）μmol/L（95%CI 1.003~1.146），提示与A2780细胞相比，SKOV3细胞对尼日菌素更敏感。

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表1

CCK-8法检测不同浓度尼日菌素对人上皮性卵巢癌A2780、SKOV3细胞活力的影响（%，±s）

表1

CCK-8法检测不同浓度尼日菌素对人上皮性卵巢癌A2780、SKOV3细胞活力的影响（%，±s）

组别		A2780细胞	P值^a	SKOV3细胞	P值^a
对照组		100.0±0.0		100.0±0.0
尼日菌素（μmol/L）
	0.312 5	95.3±3.1	0.038	96.8±2.0	0.032
	0.625	87.4±3.4	0.002	88.8±2.6	0.001
	1.25	80.4±3.3	0.000	83.2±2.2	0.000
	2.5	74.7±2.3	<0.000	77.1±2.5	<0.000
	5	65.1±2.5	<0.000	72.7±2.2	<0.000
	10	56.3±3.2	<0.000	63.0±2.2	<0.000
	20	43.9±2.7	<0.000	48.7±2.5	<0.000
	40	27.0±2.8	<0.000	36.4±2.9	<0.000
	80	17.3±3.1	<0.000	20.3±2.9	<0.000

注：各组样本数均为3；对照组为加入二甲基亚砜处理的细胞；^a与对照组比较所得

2.2　尼日菌素降低A2780、SKOV3细胞迁移和侵袭能力

不同浓度（5、10、20 μmol/L）尼日菌素分别作用于A2780和SKOV3细胞48 h后，相对于对照组，两种细胞的迁移能力均降低，且呈浓度依赖性（P<0.05），组间差异具有统计学意义（均P<0.05）（图1、表2）。Transwell侵袭实验显示，两种细胞的侵袭能力同样随着尼日菌素作用浓度的增加而受到抑制，并呈浓度依赖性下降，组间差异具有统计学意义（均P<0.05）（图2、表3）。

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表2

不同浓度尼日菌素作用人上皮性卵巢癌A2780、SKOV3细胞48 h后Transwell迁移实验穿膜细胞数比较（个/高倍视野，±s）

表2

不同浓度尼日菌素作用人上皮性卵巢癌A2780、SKOV3细胞48 h后Transwell迁移实验穿膜细胞数比较（个/高倍视野，±s）

组别		A2780细胞	P值^a	SKOV3细胞	P值^a
对照组		163±8		135.2±6.4
尼日菌素（μmol/L）
	5	121±9	0.004	120.4±2.6	0.021
	10	92±7	<0.000	91.8±5.5	0.001
	20	59±5	<0.000	80.0±4.0	0.000
F值		147.9		102.0
P值		<0.000		0.000

注：各组样本数均为3；对照组为加入二甲基亚砜处理的细胞；^a与对照组比较所得

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表3

不同浓度尼日菌素作用人上皮性卵巢癌A2780、SKOV3细胞48 h后Transwell侵袭实验穿膜细胞数比较（个/高倍视野，±s）

表3

不同浓度尼日菌素作用人上皮性卵巢癌A2780、SKOV3细胞48 h后Transwell侵袭实验穿膜细胞数比较（个/高倍视野，±s）

组别		A2780细胞	P值^a	SKOV3细胞	P值^a
对照组		73.4±4.3		104.8±2.2
尼日菌素（μmol/L）
	5	61.2±3.7	0.027	85.2±7.0	0.010
	10	43.2±4.3	<0.000	65.2±4.6	<0.000
	20	23.6±2.1	<0.000	45.6±4.4	<0.000
F值		71.1		109.9
P值		<0.000		<0.000

注：各组样本数均为3；对照组为加入二甲基亚砜处理的细胞；^a与对照组比较所得

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图1

Transwell小室法检测尼日菌素降低人上皮性卵巢癌A2780和SKOV3细胞迁移能力　结晶紫　×400　1A：A2780细胞对照组（二甲基亚砜）；1B：尼日菌素5 μmol/L处理A2780细胞；1C：尼日菌素10 μmol/L处理A2780细胞；1D：尼日菌素20 μmol/L处理A2780细胞；1E：SKOV3细胞对照组（二甲基亚砜）；1F：尼日菌素5 μmol/L处理SKOV3细胞；1G：尼日菌素10 μmol/L处理SKOV3细胞；1H：尼日菌素20 μmol/L处理SKOV3细胞

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图1

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图2

Transwell小室法检测尼日菌素降低人上皮性卵巢癌A2780和SKOV3细胞侵袭能力　结晶紫　×400　2A：A2780细胞对照组（二甲基亚砜）；2B：尼日菌素5 μmol/L处理A2780细胞；2C：尼日菌素10 μmol/L处理A2780细胞；2D：尼日菌素20 μmol/L处理A2780细胞；2E：SKOV3细胞对照组（二甲基亚砜）；2F：尼日菌素5 μmol/L处理SKOV3细胞；2G：尼日菌素10 μmol/L处理SKOV3细胞；2H：尼日菌素20 μmol/L处理SKOV3细胞

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图2

2.3　尼日菌素抑制A2780细胞的EMT进程

不同浓度（5、10和20 μmol/L）尼日菌素分别作用于细胞48 h后检测显示，E-cadherin的表达随着作用浓度的增加而升高，Vimentin、Slug、Snail和Twist的表达呈浓度依赖性减少，组间差异均具有统计学意义（均P<0.05）（图3、表4）；随尼日菌素浓度增加，SKOV3细胞中E-cadherin的表达上调，Vimentin、Slug、Snail和Twist的表达呈浓度依赖性减少，组间差异均具有统计学意义（均P<0.05）（图4、表5）。

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表4

蛋白质印迹法检测不同浓度尼日菌素作用48 h后人上皮性卵巢癌A2780细胞上皮细胞-间充质细胞转化相关蛋白浓度（μg/ml，±s）

表4

蛋白质印迹法检测不同浓度尼日菌素作用48 h后人上皮性卵巢癌A2780细胞上皮细胞-间充质细胞转化相关蛋白浓度（μg/ml，±s）

组别		样本数	Slug	P值^a	Snail	P值^a	Twist	P值^a	E⁃cadherin	P 值^a	Vimentin	P值^a
对照组		3	1.00±0.00		1.00±0.00		1.00±0.00		1.00±0.00		1.00±0.00
尼日菌素（μmol/L）
	5	3	0.84±0.02	0.010	0.53±0.15	0.048	0.76±0.02	0.003	1.25±0.03	0.007	0.88±0.03	0.038
	10	3	0.42±0.04	0.002	0.50±0.05	0.004	0.52±0.03	0.002	1.71±0.05	0.003	0.64±0.02	0.002
	20	3	0.14±0.09	0.005	0.23±0.02	0.000	0.41±0.07	0.007	2.02±0.03	0.001	0.41±0.00	<0.000
F值			128.3		32.3		86.7		334.8		325.2
P值			<0.000		<0.000		<0.000		<0.000		<0.000

注：对照组为加入二甲基亚砜处理的细胞；^a与对照组比较所得

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表5

蛋白质印迹法检测不同浓度尼日菌素作用48 h后人上皮性卵巢癌SKOV3细胞上皮细胞-间充质细胞转化相关蛋白浓度（μg/ml，±s）

表5

蛋白质印迹法检测不同浓度尼日菌素作用48 h后人上皮性卵巢癌SKOV3细胞上皮细胞-间充质细胞转化相关蛋白浓度（μg/ml，±s）

组别		样本数	Slug	P值^a	Snail	P值^a	Twist	P值^a	E⁃cadherin	P值^a	Vimentin	P值^a
对照组		3	1.00±0.00		1.00±0.00		1.00±0.00		1.00±0.00		1.00±0.00
尼日菌素（μmol/L）
	5	3	0.78±0.03	0.007	0.66±0.04	0.007	0.84±0.04	0.033	1.24±0.05	0.024	0.78±0.03	0.009
	10	3	0.53±0.02	0.001	0.47±0.05	0.005	0.49±0.00	<0.000	1.73±0.03	0.001	0.60±0.02	0.001
	20	3	0.13±0.05	0.001	0.19±0.11	0.010	0.34±0.02	0.001	2.19±0.06	0.001	0.41±0.02	0.001
F值			344.1		52.0		340.7		290.7		305.4
P值			<0.000		<0.000		<0.000		<0.000		<0.000

注：对照组为加入二甲基亚砜处理的细胞；^a与对照组比较所得

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图3

蛋白质印迹法检测不同浓度尼日菌素对人上皮性卵巢癌A2780细胞的上皮细胞-间充质细胞转化相关蛋白表达的影响

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注：DMSO为二甲基亚砜

图3

蛋白质印迹法检测不同浓度尼日菌素对人上皮性卵巢癌A2780细胞的上皮细胞-间充质细胞转化相关蛋白表达的影响

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图4

蛋白质印迹法检测不同浓度尼日菌素对人上皮性卵巢癌SKOV3细胞的上皮细胞-间充质细胞转化相关蛋白表达的影响

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注：DMSO为二甲基亚砜

图4

蛋白质印迹法检测不同浓度尼日菌素对人上皮性卵巢癌SKOV3细胞的上皮细胞-间充质细胞转化相关蛋白表达的影响

2.4　尼日菌素调节A2780、SKOV3细胞Wnt-β-catenin信号通路相关蛋白

不同浓度（5、10、20 μmol/L）尼日菌素分别作用于A2780和SKOV3细胞12 h，p-Gsk-3β蛋白的表达降低，且呈浓度依赖性（P<0.05），而总Gsk-3β蛋白的表达无变化（P>0.05）；不同浓度（5、10、20 μmol/L）尼日菌素分别作用于A2780和SKOV3细胞24 h后，β-catenin蛋白的表达降低，并呈浓度依赖性，组间差异均具有统计学意义（均P<0.05）（图5、表6）。

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表6

蛋白质印迹法检测不同浓度尼日菌素作用后人上皮性卵巢癌A2780、SKOV3细胞Wnt-β-catenin信号通路相关蛋白浓度（μg/ml，±s）

表6

蛋白质印迹法检测不同浓度尼日菌素作用后人上皮性卵巢癌A2780、SKOV3细胞Wnt-β-catenin信号通路相关蛋白浓度（μg/ml，±s）

组别		样本数	A2780细胞			SKOV3细胞
组别		样本数	Gsk3β	p⁃Gsk3β	β⁃catenin	Gsk3β	p⁃Gsk3β	β⁃catenin
对照组		3	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00
尼日菌素（μmol/L）
	5	3	0.98±0.01	0.86±0.01	0.63±0.01	1.03±0.01	0.77±0.02	0.67±0.03
	10	3	0.97±0.02	0.76±0.02	0.36±0.02	1.04±0.04	0.44±0.01	0.33±0.02
	20	3	0.96±0.03	0.41±0.03	0.24±0.01	1.04±0.02	0.19±0.01	0.15±0.02
F值			1.6	350.6	1 885.0	1.7	2 297.0	873.9
P值			0.255	<0.000	<0.000	0.248	<0.000	<0.000

注：对照组为加入二甲基亚砜处理的细胞

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图5

蛋白质印迹法检测尼日菌素抑制人上皮性卵巢癌A2780、SKOV3细胞Wnt-β-catenin信号通路相关蛋白　5A：A2780细胞；5B：SKOV3细胞

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注：DMSO为二甲基亚砜；p-Gsk3β为磷酸化Gsk3β

图5

蛋白质印迹法检测尼日菌素抑制人上皮性卵巢癌A2780、SKOV3细胞Wnt-β-catenin信号通路相关蛋白　5A：A2780细胞；5B：SKOV3细胞

3　讨论

卵巢癌是病死率最高的妇科恶性肿瘤，尽管近年来卵巢癌的治疗手段已取得了很大的进步，但患者5年生存率并没有得到明显提高。手术联合铂类为基础的化疗是目前卵巢癌的主要治疗手段，然而在经过初始治疗后，仍有75%的患者终将复发，铂类耐药是目前治疗复发性卵巢癌亟须解决的关键问题^[2]。因此，深入探讨卵巢癌侵袭转移的相关分子机制，明确与侵袭转移相关的因素，并寻找可以抑制肿瘤细胞侵袭转移的新型药物具有重要的临床意义。

EMT指上皮细胞转化为间充质细胞表型的生物学过程，主要指上皮细胞标志物如E-cadherin的增加，间叶细胞标志物如Vimentin的减少，以及Slug、Snail和Twist等EMT相关转录因子位置的改变^[3]。

尼日菌素是由Hamed等于1950年成功分离的一种聚醚离子载体一元酸抗生素，它可以催化碱金属钾离子与氢离子的交换，破坏线粒体的膜电势，促进三磷酸腺苷酶的活性，从而发挥抗生素的杀菌作用，广泛应用于抗鸡球虫病的治疗。Gupta等^[4]在进行小鼠实验时首次报道，尼日菌素抑制乳腺癌干细胞的能力较紫杉醇增强至少100倍，但其潜在的抗肿瘤机制并不清楚。Lu等^[5]报道称，与盐霉素类似，nmol级浓度的尼日菌素可以选择性抑制HEK293细胞中的Wnt信号通路。Zhou等^[6]报道尼日菌素可以通过抑制EMT进而抑制结直肠癌转移，但是其具体的作用机制仍有待进一步研究。

在本研究中，我们将不同浓度的尼日菌素分别作用于两种人EOC细胞株，结果发现尼日菌素可抑制A2780和SKOV3细胞的增殖、迁移和侵袭能力；上调EMT过程中E-cadherin的表达，同时下调间叶细胞标志物Vimentin的表达。我们进一步选取了EMT相关的转录因子进行研究，结果发现尼日菌素下调EMT相关转录因子Slug、Snail和Twist的表达，提示尼日菌素可能是通过影响EMT抑制EOC细胞的侵袭和转移。

Wnt-β-catenin信号通路可精确调控机体的生长及发育，当其过度活化或失调时，会导致机体发育异常或形成肿瘤，它的异常活化与直肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、原发性肝癌、甲状腺癌和黑色素瘤等多种肿瘤的发生发展密切相关。Novak等^[7]研究表明，β-catenin从细胞质释放进入细胞核后上调LEF-1的表达，诱导结肠上皮细胞发生EMT。Eger等^[8]发现乳腺上皮细胞发生EMT的过程中伴随着Wnt-β-catenin信号通路的激活。近年来，已有多项研究证实，Wnt-β-catenin信号通路在EOC细胞发生EMT的过程中发挥着关键性的作用。卵巢腺癌组织中GSK-3β和β-catenin的表达升高，表明Wnt通路在卵巢的发生发展中发挥一定的作用^[9]。Wnt抑制剂SFRP4可抑制浆液性卵巢癌细胞发生EMT，并降低细胞的迁移能力^[10]。因此以Wnt信号通路的关键成分为靶点，成为早期诊断和治疗卵巢癌的研究热点。本研究结果提示尼日菌素能够下调卵巢癌细胞中Wnt信号通路相关分子p-Gsk-3β、β-catenin表达，表明尼日菌素抑制EOC细胞发生EMT可能的作用机制是通过抑制Wnt-β-catenin信号通路来实现的。

总之，我们发现尼日菌素可以抑制卵巢癌细胞转移过程中的EMT过程，这可能是尼日菌素抑制卵巢癌侵袭和转移的机制之一，尼日菌素可能是通过抑制Wnt-β-catenin信号通路进而抑制卵巢癌细胞的侵袭和迁移的，提示该通路可能是尼日菌素抗肿瘤转移作用的重要机制。这些结果都表明，尼日菌素在未来卵巢癌转移的治疗中有很好的应用前景，但还需要进一步进行组织学、动物学实验来更好地阐明尼日菌素抗肿瘤作用的相关分子机制。

利益冲突

利益冲突　无

参考文献

[1]

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贡献者信息

王稳

277599　山东省滕州市中心人民医院妇产科

田翔宇

277599　山东省滕州市中心人民医院医学影像中心

赵燕

276003　山东省临沂市人民医院妇产科；250012　济南，山东大学齐鲁医院妇产科

崔秀娟

277599　山东省滕州市中心人民医院妇产科

姚淑娟

277599　山东省滕州市中心人民医院妇产科；250012　济南，山东大学齐鲁医院妇产科

张师前

250012　济南，山东大学齐鲁医院妇产科

通信作者

张师前

250012　济南，山东大学齐鲁医院妇产科

Email：r370112@126.com

关键词

卵巢肿瘤; 尼日菌素; 上皮细胞-间充质细胞转换; 细胞迁移; 细胞侵袭;

利益冲突

利益冲突　无

历史

出版日期：2018-09-28

收稿日期：2018-01-14

本文编辑

周薇

本文责任校对

周薇

Original Article

Inhibitory effect of nigericin on human epithelial ovarian cancer cells and its mechanism

Wang Wen, Tian Xiangyu, Zhao Yan, Cui Xiujuan, Yao Shujuan, Zhang Shiqian

Published 2018-09-28

Cite as Cancer Res Clinic, 2018,30(9): 597-602,606. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1006-9801.2018.09.005

Abstract

Objective

To ascertain the specific activities of nigericin on inhibiting human epithelial ovarian cancer (EOC) cells, and to investigate the possible molecular mechanism of nigericin on cell migration and invasion.

Methods

Cell viability under different treatments of nigericin (0.312 5, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 μmol/L) on EOC A2780 and SKOV3 cell lines was examined by CCK-8 assay, with DMSO as a control. The human epithelial ovarian cancer cell lines A2780 and SKOV3 were treated with 5, 10 or 20 μmol/L nigericin or with DMSO as a control. Transwell chambers was used to observe the impact of nigericin on migration and invasion of EOC cells. Western blot was used to detect the expressions of epithelial cell marker (E-cadherin), mesenchymal cell marker (Vimentin) and the epithelial-mesenchymal transition (EMT)-related transcription factors Slug, Snail, and Twist, as well as the expressions of proteins related to Wnt/β-catenin signaling pathway such as Gsk-3β, p-Gsk-3β and β-catenin under different concentration treatment of nigericin.

Results

CCK-8 assay showed that nigericin exhibited strong cytotoxicity on A2780 [IC₅₀ (16.19±0.26) μmol/L, 95% CI 1.077-1.341)] and SKOV3 [IC₅₀ (11.87±0.21) μmol/L, 95% CI 1.003-1.146] cell lines. Transwell chamber assay revealed that nigericin at different concentration (5, 10, 20 μmol/L) induced a remarkable reduction in the number of cells migrating through the membrane relative to the vehicle-treated controls in A2780 and SKOV3 cells [(121±9), (92±7), (59±5)/HP and (120.4±2.6), (91.8±5.5), (80.0±4.0)/HP, all P < 0.05]; the invasive ability of A2780 and SKOV3 cells also inhibited [(61.2±3.7), (43.2±4.3), (23.6±2.1)/HP and (85.2±7.0), (65.2±4.6), (45.6±4.4)/HP, all P < 0.05]. Western blot revealed that the increased expression of E-cadherin and decreased expression of Vimentin, Slug, Snail, Twist, p-Gsk-3β, β-catenin in EOC cells with the nigericin treatment at different concentration (5, 10 and 20 μmol/L) showed concentration dependence (P < 0.05).

Conclusion

Nigericin may induce EMT by activating Wnt-β-catenin signaling pathway to promote the migration and invasion of EOC cells.

Key words:

Ovarian neoplasms; Nigericin; Epithelial-mesenchymal transition; Migration; Invasion

Contributor Information

Wang Wen

Department of Obstetrics and Gynecology, Tengzhou Central People's Hospital, Tengzhou 277599, China

Tian Xiangyu

Department of Medical Imaging, Tengzhou Central People's Hospital, Tengzhou 277599, China

Zhao Yan

Department of Obstetrics and Gynecology, Linyi People's Hospital, Linyi 276003, China; Department of Obstetrics and Gynecology, Qilu Hospital, Shandong University, Jinan 250012, China

Cui Xiujuan

Department of Obstetrics and Gynecology, Tengzhou Central People's Hospital, Tengzhou 277599, China

Yao Shujuan

Department of Obstetrics and Gynecology, Tengzhou Central People's Hospital, Tengzhou 277599, China; Department of Obstetrics and Gynecology, Qilu Hospital, Shandong University, Jinan 250012, China

Zhang Shiqian

Department of Obstetrics and Gynecology, Qilu Hospital, Shandong University, Jinan 250012, China

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