探讨食管鳞状细胞癌中母系胚胎亮氨酸拉链蛋白激酶（MELK）的表达情况及其意义。
选取2009年8月至2013年7月北京大学肿瘤医院收治的139例食管鳞状细胞癌患者手术切除标本，通过免疫组织化学法检测食管鳞状细胞癌组织中MELK的表达情况，分析其与患者临床病理特征的关系。采用蛋白质印迹法检测MELK在6种食管鳞状细胞癌细胞株（ECA109、KYSE150、KYSE30、KYSE70、KYSE180和KYSE510）中的表达情况，选择MELK高表达的细胞株，通过慢病毒感染选择性敲低MELK的表达，采用Transwell法检测MELK对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响，采用CCK-8法验证MELK对细胞增殖活性的影响。
MELK在100例（71.9%）食管鳞状细胞癌组织中高表达，T3~T4期患者MELK阳性表达率高于T1~T2期患者（χ2=4.702，P=0.030），在肿瘤分化程度差和淋巴结转移的患者中，MELK阳性表达率高，但差异无统计学意义（χ2=2.761，P=0.097；χ2=0.994，P=0.319）。ECA109和KYSE150细胞MELK较高表达。Transwell法检测结果显示，与阴性对照组比较，ECA109和KYSE150细胞MELK敲低组迁移细胞数降低[（77±10）个比（126±8）个，t=6.56，P<0.05；（37±4）个比（105±3）个，t=24.27，P<0.05]，侵袭细胞数降低[（47±7）个比（154±9）个，t=17.08，P<0.05；（37±2）个比（184±4）个，t=54.09，P<0.05]。CCK-8检测结果显示，敲低MELK表达的ECA109和KYSE150细胞增殖活性均受抑制（均P<0.05）。
食管鳞状细胞癌患者MELK高表达与T分期相关，MELK高表达可促进食管鳞状细胞癌细胞增殖和侵袭。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
食管鳞状细胞癌与多种基因突变相关，虽然肿瘤相关的生物分子已用于食管鳞状细胞癌的诊疗评估中，但敏感性和特异性均不理想[1,2]。母系胚胎亮氨酸拉链蛋白激酶（MELK）是一种周期依赖性激酶，表达于胚胎形成过程中的上皮间质转化（EMT）区域，在正常成熟组织中仅表达于睾丸组织[3,4]。有研究报道结直肠癌、胃癌等多种恶性肿瘤中MELK呈高表达，且其高表达与患者的预后呈负相关[5,6,7]。本研究探讨食管鳞状细胞癌中MELK的表达情况以及在肿瘤发生发展中的意义。
选择2009年8月至2013年7月北京大学肿瘤医院胸外科收治的食管鳞状细胞癌手术切除标本139例。患者在手术前未经过任何化疗或放疗，所有诊断均经病理检查证实。病例有完整的基本资料，肿瘤分期采用第7版美国癌症联合会肿瘤分期系统。所用病历资料来自北京大学肿瘤医院统计室。
采用EnVision二步法。MELK阳性表达定位于细胞质。MELK表达水平根据细胞染色强度及阳性细胞比例综合判定：-为无细胞着色；±为<10%细胞着色；+为10%~20%细胞呈弱阳性着色；++为10%~20%的细胞呈中等强度着色，或20%~50%细胞呈弱阳性着色；+++为20%~50%细胞呈中等强度及以上着色，或>50%细胞呈弱阳性着色。根据判定结果将MELK表达分为阴性表达（-、±、+）及阳性表达（++、+++）。
选择6种人食管鳞状细胞癌细胞株ECA109、KYSE150、KYSE30、KYSE70、KYSE180和KYSE510（由中国医学科学院肿瘤医院惠赠）。细胞均采用含10%胎牛血清的RPMI 1640或达氏修正依氏培养液（DMEM）培养，加入青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 μg/ml），在5% CO2、37 ℃和100%湿度的培养箱内培养，取生长状态良好的细胞用于实验。
BCA Protein Assay Kit购自上海碧云天生物技术有限公司。经过总蛋白提取、SDS-PAGE电泳、免疫印迹、抗体杂交，采用Pierce ECL Western blot substrate试剂盒X线显影，检测6种细胞株MELK蛋白的表达水平。
采用TRIzol试剂（1 ml/10 cm2）（上海普飞生物技术公司）提取细胞总RNA，采用美国Promega公司M-MLV试剂盒将RNA反转录为cDNA。GAPDH为内对照，MELK正向引物5'-TATTCACCTCGATGAT GATTGCG-3'，反向引物5'-AGAAAGCCTTAAACGAA CTGGTT-3'。以2-ΔΔCt表示MELK mRNA相对表达量。
载体构建由上海吉凯基因公司完成。扩增经过文献验证的MELK基因特异性shRNA序列（正向引物5'-TATTCACCTCGATGATGATTGCG-3'，反向引物5'-A GAAAGCCTTAAACGAACTGGTT-3'），设计相应阴性对照序列。扩增的序列构建至慢病毒穿梭质粒载体pGLV3/H1/GFP/Puro上。扩增质粒转入慢病毒，利用包装好的shRNA慢病毒液感染高表达MELK的细胞株ECA109、KYSE150，转染并利用嘌呤霉素最优筛选浓度筛选稳定感染细胞株。
对高表达MELK的细胞株ECA109、KYSE150进行细胞迁移实验及侵袭实验。每种细胞株实验分组为：阴性对照组（目的细胞加阴性对照病毒感染组）；MELK敲低组（目的细胞加目的基因shRNA慢病毒感染组）。Transwell小室（美国Corning公司）底层为通透性聚碳酸酯膜，上室为无血清细胞悬液，下室为含血清的培养液，以穿过滤膜细胞数评价细胞的迁移能力。在微孔滤膜上铺一层Matrigel胶，体外模拟基底膜，计数穿过滤膜的细胞数，评价细胞侵袭能力。实验重复3次，计数5个视野的细胞数，计算平均值。
将处于对数生长期的各实验组（分组方法同细胞迁移和侵袭实验）细胞胰酶消化后，用完全培养液重悬细胞，并计数。根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度（多数为2 000个/孔），统一铺好后，待细胞完全沉淀下来，在显微镜下观察各实验组的细胞密度。从铺板后第2天开始，培养终止前2~4 h加入10 μl CCK-8试剂（美国Sigma-Aldrich公司），无需换液。4 h后96孔板置于振荡器上振荡2~5 min，酶标仪检测450 nm处吸光度（A）值。将不同组各时间点的结果进行统计后绘制细胞的生长曲线。实验重复3次，比较各组A450随时间变化情况。
采用SPSS 18.0统计学软件。计量资料符合正态分布，以均数±标准差（
±s）表示，两组间比较采用t检验；两组间计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
食管鳞状细胞癌组织中MELK阳性表达主要位于胞质。MELK表达水平-、+、++和+++的分别有31例（22.3%）、8例（5.8%）、59例（42.4%）和41例（29.5%）（图1）。MELK蛋白阳性表达率在T3~T4期患者中高于T1~T2期患者，差异有统计学意义（χ2=4.702，P=0.030）。MELK阳性表达率在患者年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤分化程度、肿瘤直径、区域淋巴结转移及脉管癌栓临床病理特征分层间差异均无统计学意义（均P>0.05）（表1）。
食管鳞状细胞癌组织中母系胚胎亮氨酸拉链蛋白激酶（MELK）表达与患者临床病理特征的相关性[例（%）]
食管鳞状细胞癌组织中母系胚胎亮氨酸拉链蛋白激酶（MELK）表达与患者临床病理特征的相关性[例（%）]
| 临床病理特征 | 例数 | MELK表达 | χ2值 | P值 | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 阴性 | 阳性 | |||||
| 年龄（岁） | ||||||
| ≤60 | 69 | 22（31.9） | 47（68.1） | 0.994 | 0.319 | |
| >60 | 70 | 17（24.3） | 53（75.7） | |||
| 性别 | ||||||
| 男 | 117 | 34（29.1） | 83（70.9） | 0.368 | 0.544 | |
| 女 | 22 | 5（22.7） | 17（77.3） | |||
| 肿瘤位置 | ||||||
| 中段 | 57 | 14（24.6） | 43（75.4） | 0.585 | 0.444 | |
| 下段 | 82 | 25（30.5） | 57（69.5） | |||
| 分化程度 | ||||||
| 低 | 35 | 6（17.1） | 29（82.9） | 2.761 | 0.097 | |
| 中、高 | 104 | 33（31.7） | 71（68.3） | |||
| 肿瘤直径（cm） | ||||||
| ≤3.5 | 76 | 20（26.3） | 56（73.7） | 0.252 | 0.616 | |
| >3.5 | 63 | 19（30.2） | 44（69.8） | |||
| T分期 | ||||||
| T1～T2 | 45 | 18（40.0） | 27（60.0） | 4.702 | 0.030 | |
| T3～T4 | 94 | 21（22.3） | 73（77.7） | |||
| 淋巴结转移 | ||||||
| 是 | 70 | 17（24.3） | 53（75.7） | 0.994 | 0.319 | |
| 否 | 69 | 22（31.9） | 47（68.1） | |||
| 脉管癌栓 | ||||||
| 是 | 32 | 9（28.1） | 23（71.9） | 0.000 | 0.992 | |
| 否 | 107 | 30（28.0） | 77（72.0） | |||
蛋白质印迹法检测发现，ECA109和KYSE150细胞高表达MELK蛋白（图2）。KYSE30、KYSE70、ECA109、KYSE150、KYSE180、KYSE510细胞株MELK mRNA相对表达量分别为0.221±0.016、0.084±0.007、0.406±0.017、0.934±0.025、0.064±0.009、0.180±0.012，结果显示ECA109和KYSE150细胞高表达MELK mRNA，故选择ECA109和KYSE150细胞进行后续实验。
利用包装好的MELK shRNA慢病毒液感染ECA109和KYSE150细胞，嘌呤霉素筛选稳定感染的细胞株，结果显示ECA109和KYSE150细胞均感染成功（图3）。
细胞迁移实验结果显示，ECA109细胞MELK敲低组每视野细胞迁移数较阴性对照组少[（77±10）个比（126±8）个，t=6.56，P<0.05]。KYSE150细胞MELK敲低组每视野细胞迁移数也较阴性对照组少[（37±4）个比（105±3）个，t=24.27，P<0.05]。侵袭能力检测结果显示，ECA109细胞MELK敲低组每视野细胞侵袭数较阴性对照组少[（47±7）个比（154±9）个，t=17.08，P<0.05]，KYSE150细胞MELK敲低组侵袭细胞数亦低于阴性对照组[（37±2）个比（184±4）个，t=54.09，P<0.05]（图4）。
注：阴性对照组为经阴性对照病毒感染细胞；MELK敲低组为经MELK基因shRNA慢病毒感染细胞
CCK-8法检测结果显示，ECA109和KYSE150细胞MELK敲低组与阴性对照组有活力细胞数均降低，ECA109细胞第5天两组A450分别为0.78±0.02比0.52±0.01（t=25.12，P<0.05），KYSE150细胞第5天两组A450分别为0.85±0.01比0.51±0.02（t=21.49，P<0.05）。提示MELK表达水平可能影响食管鳞状细胞癌细胞株的增殖能力（图5）。
注：阴性对照组为阴性对照病毒感染的细胞；MELK敲低组为MELK基因shRNA慢病毒感染的细胞；细胞增殖能力以450 nm吸光度（A450）值表示
MELK在多种肿瘤中呈现高表达，包括乳腺癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、结直肠癌[8,9,10,11]，在白血病中也呈现高表达[12]。MELK的过表达与乳腺癌、胶质瘤和前列腺癌的不良预后密切相关[13,14]。然而MELK在鳞状上皮来源恶性肿瘤中的表达研究鲜有报道。本研究发现MELK在食管鳞状细胞癌组织中呈现高表达，与肿瘤T分期相关，显示MELK与食管鳞状细胞癌侵袭性有关。Wang等[15]研究发现56.92%子宫颈癌患者高表达MELK，MELK表达水平与组织恶性程度分级呈正相关，并且促进早期子宫颈癌转移。本研究MELK在6种食管鳞状细胞癌细胞株中均表达，选择高表达MELK的ECA109和KYSE150细胞进行shRNA干扰MELK的表达，结果显示敲低MELK可抑制食管鳞状细胞癌细胞侵袭能力和转移能力。有研究显示MELK能促进胃癌细胞增殖、侵袭和转移[16,17]。Du等[18]研究提示MELK促进胃癌细胞株的侵袭和转移，并在小鼠的体外实验中证实MELK高表达能促进胃癌细胞株的腹膜转移，这种侵袭转移可能和FAK-Paxillin信号通路相关。
肿瘤转移的一个重要分子阶段就是EMT，它能赋予细胞侵袭和转移的能力[16,17]。EMT过程中发生了细胞间紧密连接的解除、细胞形态变得更圆和失去了上皮细胞的极性[19,20]。在EMT过程中，肿瘤细胞下调细胞黏连蛋白的表达，如E钙黏蛋白和γ-catenin蛋白上调间质蛋白的表达，其中E钙黏蛋白的下调是EMT发生的标志[21]。有研究发现，转化生长因子β可下调MELK表达，从而抑制EMT发生[22]。
MELK通过多种作用机制促进肿瘤的发生和发展。MELK通过与促凋亡因子bcl-G的相互作用实现其抗凋亡活性。MELK的过表达抑制了bcl-G诱导的凋亡，从而促使乳腺肿瘤的形成[23]。MELK异常激活肿瘤干细胞，从而使肿瘤细胞获得生长优势，加速肿瘤恶化[9,24]。Janostiak等[25]发现黑色素瘤被NF-κB激活的MAPK通路可上调MELK表达，从而促进黑色素瘤生长。本实验证实MELK能增强食管鳞状细胞癌细胞的侵袭、转移能力，其具体机制有待后续研究探索。
本研究发现在食管鳞状细胞癌组织中MELK高表达，其与肿瘤T分期具有相关性。验证了MELK表达可促进食管鳞状细胞癌细胞发生迁移、侵袭和增殖。然而本研究未发现淋巴结转移与MELK表达有关，考虑可能与研究样本量较小有关，另外不同起源肿瘤的生物学行为或许存在差异性，其结果可能产生偏倚，扩大临床研究样本或能进一步证实MELK与食管鳞状细胞癌临床病理特征的相关性。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
