薛华; 赵松颖; 王静; 范丽霞; 化罗明; 罗建民

doi:10.3760/cma.j.issn.1009-9921.2015.02.008

点赞 0
分享 0
收藏 0
纠错

• 论著 •

miR-155对含SH2区域的肌醇5'磷酸酶1转录后调控在急性髓系白血病发病机制中作用的初步研究

白血病·淋巴瘤, 2015,24(2) : 96-100. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9921.2015.02.008

摘要

目的

探讨miR-155对人类含SH2区域的肌醇5'磷酸酶1(SHIP1)的转录后调控在急性髓系白血病(AML)发病机制中的作用。

方法

应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测30例AML患者miR-155、SHIP1的mRNA表达水平，选取同年龄健康人骨髓为对照组。人白血病U937细胞转染miR-155类似物后，RT-PCR法检测转染细胞中miR-155、SHIP1的mRNA表达水平。Western blot法检测转染后细胞SHIP1、AKT、pAKT蛋白水平。流式细胞术检测转染后细胞凋亡的变化。

结果

30例AML患者中，15例AML-M₄及AML-M₅患者SHIP1蛋白水平较非AML-M₄及AML-M₅患者明显降低，而miR-155表达水平相应升高(均P<0.05)。U937细胞转染miR-155后，SHIP1蛋白水平较转染阴性对照组降低(P<0.05)，而p-AKT水平较转染阴性对照组明显升高，转染后细胞凋亡明显受抑(P<0.05)。

结论

miR-155可对SHIP1进行转录后调控，miR-155可能通过降低SHIP1活性而激活PI3K-AKT途径，抑制白血病细胞的凋亡，从而促进AML的发生。

引用本文: 薛华, 赵松颖, 王静, 等. miR-155对含SH2区域的肌醇5'磷酸酶1转录后调控在急性髓系白血病发病机制中作用的初步研究 [J] . 白血病·淋巴瘤, 2015, 24(2) : 96-100. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9921.2015.02.008.

参考文献导出: Endnote NoteExpress RefWorks NoteFirst 医学文献王

扫描看全文

正文

作者信息

基金 0 关键词 0

English Abstract

阅读 0 评论 0

相关资源

引用 | 论文 | 视频

版权归中华医学会所有。

未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。

除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。

人类含SH2区域的肌醇5'磷酸酶1(SHIP1)基因属于肌醇5'磷酸酶家族，是抑制PI3K-AKT途径活化的重要负性调控因子，已有研究证实SHIP1基因的点突变在急性髓系白血病(AML)中导致SHIP1抑癌活性降低^[1,2]，促进AML发病。而SHIP1是miR-155的目标基因之一^[3]，在AML中可能存在SHIP1的转录后调控。本研究对AML患者及白血病细胞系的SHIP1活性及miR-155的表达进行了检测，并通过在白血病细胞系中转染miR-155类似物，对SHIP1活性的变化在AML发病机制中的作用进行了研究。

1　材料与方法

1.1　主要试剂和仪器

miR-155前向引物：5'-CCCCTATCACGATTAGCA TTAA-3' ；U6前向引物：5'-GCAGGGGCCATGCTAATC TTCTCTGTATCG-3' ；SHIP1前向引物：5'-GCGTGCTGT ATCGGAATTGC-3' ，反向引物：5'-TGGTGAAGAACCT CATGGAGAC-3' ；GAPDH前向引物：5'-ACCACAGTCC ATGCCATCACT-3' ，反向引物：5'-TCCACCACCCTGTT GCTGTA-3' ；miR-155-5p类似物(mimic)序列：5'-UA AUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3' ，5'-CCCUAUCACG AUUAGCAUUAAUU-3' ；miR-155-5p类似物的阴性对照序列：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3' ，5'-ACG UGACACGUUCGGAGAATT-3'。引物及类似物、阴性对照均由美国Invitrogen公司合成。X-treme GENE siRNA Transfection Reagent(瑞士Roche公司产品)，TRIzol Reagent(美国Invitrogen Life Technologies公司)、荧光时实定量PCR仪(美国ABI公司)，All-in-One miRNA定量反转录(qRT)-PCR Detection System(广州复能基因公司)；Nanodrop微量分光光度计(美国Thermo公司)；抗SHIP1、AKT、p-AKT单抗(美国CST公司)，抗β-actin抗体(美国Santa Cruz公司)，抗兔rabbit抗体(英国Abcam公司)，流式细胞仪(美国BD公司)。Annexin V FITC细胞凋亡检测试剂盒(中国碧云天公司)。

1.2　临床标本

骨髓或外周血标本取自2012年10月至2013年10月在河北大学附属医院住院的30例初诊AML患者，经MICM分型确诊。其中男性18例，女性12例；中位年龄36岁(22~ 55岁)，中位白细胞计数(WBC)34.6×10⁹/L(1.0×10⁹～138.0×10⁹/L)。WHO分型：伴有重现性细胞遗传学异常的AML 4例，伴有多系病态造血的AML2例，不另作分类的AML 24例。不另作分类的24例AML患者FAB分型：M₁ 3例，M₂ 5例，M₄ 6例，M₅ 9例，M₆ 1例。收集10名健康人骨髓作为对照。骨髓或外周血单个核细胞离心后提取RNA及蛋白质，实时PCR检测miR-155与SHIP1的表达，Western blot法检测SHP1蛋白表达水平。RNA提取、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及实时PCR具体方法同本研究中的细胞实验方法。本研究得到医院伦理委员会批准，并得到患者及家属知情同意。

1.3　细胞株培养与转染

人白血病U937细胞系购自天津中国医学科学院血液学研究所，用含10％血清、2 mmol/L谷氨酰胺及链霉素的RPMI 1640培养液，在37 ℃、5 % CO₂的细胞培养箱中培养。U937细胞分三组：未转染对照组(U937c)、转染阴性对照组(U937mc)和转染miR-155类似物组(U937m)，U937m组根据X-treme GENE siRNA Transfection Reagent说明书进行miR-155类似物的转染。U937c组和U937mc组分别用无血清RPMI 1640培养液或miR-155类似物的阴性对照试剂转染，转染终浓度均为50 nmol/L。在细胞转染48 h后检测基因表达以及细胞凋亡。实验均重复3次。

1.4　细胞RNA提取和定量PCR

细胞转染48 h后应用TRIzol提取各组细胞总RNA。应用Nanodrop微量分光光度计检测RNA质量。PCR实验均重复3次。

miR-155基因表达检测：应用All-in-One miRNA qRT-PCR试剂盒进行反转录和基因扩增。选取U6为内参基因。所有反应在ABI Prism 7000 PCR仪中进行。应用2^-ΔΔCt法计算miR-155相对表达量。

SHIP1基因表达的检测：应用Quant One Step SYBR qRT-PCR Master进行RNA的反转录以及cDNA扩增。其中50 μl的PCR体系包括：25 μl 2×Quant One Step SYBR qRT-PCR Master mix，2.5 μl 2.5 U/μl Hot master Taq聚合酶，0.4 μl Quant RNA酶，2 μl前向引物(10 pmol/L)，2 μl反向引物(10 pmol/L)以及2 μg总RNA，加入蒸馏水至50 μl。所有反应在ABI Prism 7000 PCR仪中进行。选取GAPDH为内参基因，应用2^-ΔΔCt法计算SHIP1相对表达量。

1.5　Western blot检测SHIP1、p-AKT及AKT蛋白表达

应用RIPA蛋白裂解液对细胞进行消化和蛋白提取，应用Bradford方法检测蛋白浓度。20 μg总蛋白提取物经电泳、转膜、封闭后，分别加入针对SHIP1、AKT、p-AKT的抗体(浓度均为1∶1 000)和抗β-actin抗体(1∶1 000)4 ℃过夜，随后予以抗兔二抗(1∶10 000)反应，ECL显色后应用Quantity One软件分析数据，以β-actin为内参计算基因在蛋白水平的相对表达。实验重复3次。

1.6　凋亡检测

参照Annexin V FITC细胞凋亡检测试剂盒说明对细胞进行处理，通过流式细胞术检测三组细胞的凋亡情况。应用FACS Diva软件进行数据分析。

1.7　统计学方法

应用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差(±s)表示，对其分析采用单因素方差分析和Student'st检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　SHIP1和miR-155在AML患者中的表达

AML患者骨髓SHIP1蛋白表达情况见图1。在各AML亚型中，AML-M₄和AML-M₅亚型患者(1组)SHIP1蛋白表达较非AML-M₄或AML-M₅亚型的AML患者(2组)明显降低。1组患者15例，SHIP蛋白表达水平0.93±0.11；2组患者15例，SHIP1蛋白表达水平2.55±1.13；健康对照组(3组)10名，SHIP蛋白水平为8.32±2.14。1组和2组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与2组比较，1组患者尽管骨髓SHIP1的蛋白量低，但二组SHIPI在mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05)，而1组miR-155表达水平较2组升高(P<0.05)(表1)。

点击查看表格

表1

初诊急性髓系白血病(AML)患者骨髓miR-155与SHIP1 mRNA表达水平(±s)

表1

初诊急性髓系白血病(AML)患者骨髓miR-155与SHIP1 mRNA表达水平(±s)

组别		例数	SHIP1	miR-155
AML组
	AML-M₄+AML-M₅	15	0.021±0.009	5.50±1.40
	非AML-M₄+AML-M₅	15	0.018±0.007	2.75±0.48
健康对照组		10	0.112±0.028	0.00±0.00
t值^a			1.052	1.960
P值^a			0.305 0	0.040 9

注：SHIP1为含SH2区域的肌醇5'磷酸酶1;^aAML-M₄+AML-M₅组和非AML-M₄+AML-M₅比较；用2^-ΔΔCt法表示基因mRNA表达水平

点击查看大图

图1

初诊急性髓系白血病(AML)患者骨髓含SH2区域的肌醇5'磷酸酶1(SHIP1)蛋白表达水平

点击查看大图

图1

初诊急性髓系白血病(AML)患者骨髓含SH2区域的肌醇5'磷酸酶1(SHIP1)蛋白表达水平

2.2　miR-155转染对U937细胞基因表达的影响

相对于U937c组以及U937mc组，转染miR-155类似物可导致U937细胞中miR-155的表达升高(P<0.05)(表2)，提示转染成功。与U937c组以及U937mc组相比，转染U937m组细胞未见SHIP1在mRNA水平的改变，但SHIP1蛋白表达水平降低(P<0.05)，提示miR-155对SHIP1可能存在转录后的基因表达调节，SHIP1是miR-155的靶基因。相对于U937c组以及U937mc组，miR-155类似物转染并未导致AKT蛋白水平的变化，但p-AKT蛋白含量升高(P<0.05)(表2、图2)，提示miR-155表达增加可以导致活化的AKT增加。

点击查看表格

表2

不同处理组人白血病U937细胞各基因mRNA及蛋白表达水平比较(±s)

表2

不同处理组人白血病U937细胞各基因mRNA及蛋白表达水平比较(±s)

组别	样本数	miR-155	SHIP1		AKT蛋白	PAKT蛋白
组别	样本数	miR-155	mRNA	蛋白	AKT蛋白	PAKT蛋白
未转染对照组	3	1	1	-	-	-
转染阴性对照组	3	0.33±0.13	0.95±0.29	0.77±0.27	91.10±15.02	22.05±15.42
转染miR-155类似物组	3	85.50±6.43	0.91±0.25	0.32±0.19	86.09±13.80	57.23±8.80
t值^a		22.750	0.675	-	-	-
P值^a		<0.000 1	0.537 0	-	-	-
t值^b		22.930	0.211	3.568	0.426	3.424
P值^b		<0.000 1	0.843 5	0.023 4	0.691 9	0.026 7

注：SHIP1为含SH2区域的肌醇5'磷酸酶1：^a转染miR-155类似物组与未转染对照组比较;^b转染miR-155类似物组与转染阴性对照组比较;用2^-ΔΔCt法表示基因mRNA表达水平；用相对于β-actin表示各蛋白水平

点击查看大图

图2

不同处理组人白血病U937细胞含SH2区域的肌醇5'磷酸酶1(SHIP1)与AKT蛋白表达水平

点击查看大图

U937m：转染miR-155类似物组；U937mc：转染阴性对照组

图2

不同处理组人白血病U937细胞含SH2区域的肌醇5'磷酸酶1(SHIP1)与AKT蛋白表达水平

2.3　miR-155转染对U937细胞凋亡的影响

U937c、U937mc、U937m组细胞凋亡率分别为(2.080 ± 0.684)%、(0.306±0.196)%、(0.187±0.977)%，同U937mc相比，U937m细胞凋亡率下降，差异有统计学意义(t=4.314，P= 0.012 5)(图3)。

点击查看大图

图3

流式细胞术检测不同处理组人白血病U937细胞凋亡情况

点击查看大图

U937c：未转染对照组；U937m：转染miR-155类似物组；U937mc：转染阴性对照组

图3

流式细胞术检测不同处理组人白血病U937细胞凋亡情况

3　讨论

PI3K-AKT信号通路是细胞内重要的信号转导通路之一，其过度激活会影响下游多种效应分子的活化状态，在细胞内发挥抑制凋亡、促进增殖的关键作用^[4]。PI3K-AKT途径在50 %～ 70％的AML发病中发挥重要作用，但其具体机制不详。人类SHIP1基因是抑制PI3K-AKT途径活化的重要负性调控因子^[5,6,7]。我们在前期工作中发现，AML患者SHIP1基因的点突变导致其功能失活，促进了AML发病^[1,2]。但SHIP1的点突变发生率并不高，我们的研究首次报道了在AML中除了点突变的其他机制对SHIP1功能的抑制。

与Metzner等^[6]的研究一致，本研究发现AML患者中SHIP1的蛋白表达水平异质性较强。蛋白表达水平显著下降的发生机制可能为：高甲基化修饰、蛋白酶体降解增加、微小RNA的转录后调控。Lee等^[8]的研究表明，人类SHIP1的启动子上没有CpG岛，而将去甲基药物或蛋白酶体抑制剂作用于SHIP1缺失的细胞系，均未导致SHIP1蛋白表达明显增加。因此我们推测微小RNA的调控可能是AML中SHIP1蛋白表达水平显著下降的主要机制。目前相关研究已证实SHIP1是miR-155的目标基因之一^{[3, 9]}。我们进一步检测了SHIP1蛋白表达明显下降的AML患者中miR-155的表达水平，结果证实miR-155表达水平明显上升，二者表现为负相关性。

随后我们的体外研究表明，白血病细胞系中转染miR-155类似物后，SHIP1 mRNA水平较转染前无明显变化，而蛋白水平表达明显下降，证实了SHIP1在AML中也为miR-155的靶标，miR-155对SHIP1的转录后调控是使AML SHIP1失活的原因。这一点在B细胞淋巴瘤、NK/T细胞白血病及急性淋巴细胞白血病中已被证实^{[10,11,12,13]}。

在白血病细胞系U937中，过表达miR-155使SHIP1蛋白水平下降，活化的AKT增加，激活了PI3K-AKT途径，抑制了白血病细胞的凋亡。SHIP1抑癌活性的缺失导致了PI3K-AKT途径的激活，这可能是PI3K-AKT信号通路参与AML发病机制的重要途径。

CALGB等大系列研究证实FMS样的酪氨酸激酶3/内在重复序列(FLT3/ITD)突变阳性的AML患者miR-155水平升高^[14,15]，也有研究发现SHIP1蛋白水平明显下降的AML为FLT3/ITD阳性^[6]。O'Connell等^[16]研究发现miR-155在AML-M₄或AML-M₅中表达水平明显升高，我们的结果与此结论相符。我们的研究中，SHIP1活性降低的15例AML-M₄或AML-M₅患者中10例为正常核型，共有8例行FLT3/ITD检测，其中6例阳性。FLT3/ITD的突变可能是调控miR-155的上游机制^[17]。单核细胞白血病与miR-155/SHIP1及FLT3/ITD的关系，尚待扩大病例数进一步研究。

我们的研究证实了miR-155对SHIP1的转录后调控是使SHIP1失活的原因之一。miR-155通过降低SHIP1活性从而激活PI3K-AKT通路，抑制了白血病细胞的凋亡，从而促进了AML的发生。

参考文献

[1]

LuoJM, LiuZL, HaoHL，et al. Mutation analysis of SHIP gene in acute leukemia [J]. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi，2004，12(4):420-426.

[2]

LiuXJ, YangL, WenSP，et al. Effect of SHIP mutation on invasion and migration of K562 leukemia cells [J]. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi，2012，33(1):38-42.

[3]

O'ConnellRM, ChaudhuriAA, RaoDS，et al. Inositol phosphatase SHIP1 is a primary target of miR-155[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(17):7113-7118.

[4]

ReikvamH, NepstadI, BruserudØ，et al. Pharmacological targeting of the PI3K/mTOR pathway alters the release of angioregulatory mediators both from primary human acute myeloid leukemia cells and their neighboring stromal cells[J]. Oncotarget，2013，4(6):830-843.

[5]

BrauerH, StraussJ, WegnerW，et al. Leukemia-associated mutations in SHIP1 inhibit its enzymatic activity，interaction with the GM-CSF receptor and Grb2，and its ability to inactivate PI3K/AKT signaling [J]. Cell Signal，2012，24(11)：2095-2101.

[6]

MetznerA, PrechtC, FehseB，et al. Reduced proliferation of CD34(+)cells from patients with acute myeloid leukemia after gene transfer of INPP5D[J]. Gene Therapy，2009，16：570-573.

[7]

ViernesDR, ChoiLB, KerrWG，et al. Discovery and development of small molecule SHIP phosphatase modulators[J]. Med Res Rev，2014，34(4):795-824.

[8]

LeeDW, FutamiM, CarrollM，et al. Loss of SHIP-1 protein expression in high-risk myelodysplastic syndromes is associated with miR-210 and miR-155[J]. Oncogene，2012，31(37):4085-4094.

[9]

WuR, LiY, GuoZ，et al. Triptolide ameliorates ileocolonic anastomosis inflammation in IL-10 deficient mice by mechanism involving suppression of miR-155/SHIP-1 signaling pathway. [J]. Mol Immunol，2013，56(4)：340-346.

[10]

PedersenIM, OteroD, KaoE，et al. Onco-miR-155 targets SHIP1 to promote TNFalpha-dependent growth of B cell lymphomas[J]. EMBO Mol Med，2009，1(5):288-295.

[11]

CostineanS, SandhuSK, PedersenIM，et al. Src homology 2 domain-containing inositol-5-phosphatase and CCAAT enhancer-binding protein beta are targeted by miR-155 in B cells of Emicro-MiR-155 transgenic mice [J]. Blood，2009，114(7)：1374-1382.

[12]

HuangX, ShenY, LiuM，et al. Quantitative proteomics reveals that miR-155 regulates the PI3K-AKT pathway in diffuse large B-cell lymphoma[J]. Am J Pathol，2012，181(1):26-33.

[13]

YamanakaY, TagawaH, TakahashiN，et al. Aberrant overexpression of microRNAs activate AKT signaling via downregulation of tumor suppressors in natural killer cell lymphoma/leukemia[J]. Blood，2009，114(15):3265-3275.

[14]

WhitmanSP, MaharryK, RadmacherMD，et al. FLT3 internal tandem duplication associates with adverse outcome and gene-and microRNA-expression signatures in patients 60 years of age or older with primary cytogenetically normal acute myeloid leukemia：a Cancer and Leukemia Group B study[J]. Blood，2010，116(18):3622-3626.

[15]

MarcucciG, MaharryKS, MetzelerKH，et al. Clinical role of microRNAs in cytogenetically normal acute myeloid leukemia：miR-155 upregulation independently identifies high-risk patients[J]. J Clin Oncol，2013，31：2086-2093.

[16]

O'ConnellRM, RaoDS, ChaudhuriAA，et al. Sustained expression of microRNA-155 in hematopoietic stem cells causes a myeloprolierative disorder [J]. J Exp Med，2008，205(3)：585-594.

[17]

AlachkarH, SanthanamR, HarbJG，et al. Silvestrol exhibits significant in vivo and in vitro antileukemic activities and inhibits FLT3 and miR-155 expressions in acute myeloid leukemia [J]. J Hematol Oncol，2013，6：21.

贡献者信息

薛华

071000　保定，河北大学附属医院血液科

赵松颖

071000　保定，河北大学附属医院血液科

王静

071000　保定，河北大学附属医院血液科

范丽霞

071000　保定，河北大学附属医院血液科

化罗明

071000　保定，河北大学附属医院血液科

罗建民

河北医科大学第二医院血液科

通信作者

化罗明

071000　保定，河北大学附属医院血液科

Email：hualuoming@sohu.com

关键词

白血病，髓样，急性; 肌醇5'磷酸酶1; miRNA-155;

基金项目

河北大学医学学科专项资金建设项目（2013B2001）

保定市科学技术研究与发展指导计划（14ZF097）

历史

出版日期：2015-02-25

收稿日期：2014-12-26

本文编辑

吕晶丽

Original Article

Preliminary study of role of post-transcription regulation on SH2 domain-containing inositol 5'-phosphatase 1 gene expression by miR-155 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia

Hua Xue, Songying Zhao, Jing Wang, Lixia Fan, Luoming Hua, Jianmin Luo

Published 2015-02-25

Cite as J Leuk Lymphoma, 2015, 24(2): 96-100. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9921.2015.02.008

Abstract

Objective

To investigate the role of microRNA-155(miR-155)on post-transcription regulation of SH2 domain-containing inositol 5'-phosphatase 1(SHIP1)gene expression in the pathogenesis of acute myeloid leukemia(AML).

Methods

Quantitative real-time polymerase chain reaction(RT-PCR)was performed to detect the expression of miR-155 and SHIP1 mRNA in the AML patients and controls. miR-155 mimics was transfected into U937cells(U937m)by using X-treme GENE siRNA transfection reagent. Cells without transfection(U937c)and cells with negative transfection(U937mc)were used as controls. RT-PCR was performed to detect the expression of miR-155 and SHIP1 mRNA in these cells. The expression of SHIP1, TAKT and pAKT were detected by Western blot in U937 cells. Apoptosis was studied by flow cytometry(FCM).

Results

The average level of SHIP1 protein content in 15 samples of patients with AML-M₄ or AML-M₅ from 30 AML patients was significantly lower compared with that of patients with the other types of AML, and the levels of miR-155 were significantly higher in the same group of patients(P < 0.05). Significantly decreased levels of SHIP1 protein were found in U937m cells compared that of U937c and U937mc(P < 0.05). Significantly decreased rate of apoptosis was observed in U937m cells compared with that of U937mc and U937c. U937m cells also exhibited no alteration in total AKT content, while increased p-AKT levels were found(P < 0.05).

Conclusion

SHIP1 was also a primary target of miR-155 in AML. Overexpression of miR-155 could activate PI3K-AKT pathway to depressing SHIP1 and decrease the apoptosis rate of AML cells.

Key words:

Leukemia, myeloid, acute; SH2 domain-containing inositol 5'-phosphatase 1; miR-155

Contributor Information

Hua Xue

Department of Hematology, Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, China

Songying Zhao

Jing Wang

Lixia Fan

Luoming Hua

Jianmin Luo

共有条评论

验证码

本文被引情况 CSCD: 0次万方数据： 0次 Scopus: 0次

施引文献(最多仅列5条文献，进入CSCD官网发现更多)

未获取施引文献信息...

暂无相关资源