观察乙酰肝素酶（HPA）及其相关因子mRNA在白血病细胞中的表达，研究白血病细胞表面止血平衡改变。
选取白血病患者40例（研究组），缺铁性贫血患者20例（对照组）。采用半定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法测定受试者骨髓单个核细胞组织因子（TF）、尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）、HPA mRNA的含量。
研究组骨髓中单个核细胞TF、uPAR、HPA mRNA的表达与对照组相比均升高（均P<0.05），35例初发白血病患者中急性髓系白血病（AML）组（23例）骨髓中单个核细胞TF、uPAR、HPA mRNA高于慢性粒细胞白血病（CML）组（4例）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）组（3例）、急性淋巴细胞白血病（ALL）组（5例）（对照组、AML组、CML组、ALL组、CLL组TF分别为0.66±0.03、2.56±0.37、1.33±0.06、1.93±0.08、1.23±0.07，uPAR分别为0.53±0.02、1.89±0.26、0.92± 0.15、1.44±0.01、1.19±0.16, HPA分别为2.37±0.24、1.42±0.13、1.68±0.09、1.54±0.12，均P<0.05）。
白血病细胞中HPA、TF、uPAR mRNA表达增高；不同类型白血病表达水平不同。提示TF、uPAR、HPA可能影响白血病细胞表面止血平衡，不同类型白血病细胞表面止血平衡改变不同。
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白血病是血液系统常见恶性肿瘤，患者同时存在血栓与出血危险，即血栓出血综合征（thrombohemorrhagic syndromes, THS），严重时威胁生命[1,2]。不同类型白血病出血和血栓发生率不同。本研究针对不同类型白血病患者，应用半定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测白血病患者骨髓单个核细胞组织因子（TF）、尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）、乙酰肝素酶（HPA) mRNA的含量，研究不同类型白血病细胞表面止血平衡和血浆凝血改变，以明确不同类型急性白血病止血紊乱机制，为临床治疗提供理论依据。
白血病40例（研究组）均为我科2009年1月至2011年2月住院患者，其中男18例，女22例，年龄6~ 75岁，中位年龄43岁。均根据临床表现、血象、骨髓象、细胞化学染色、细胞遗传学、分子生物学及流式细胞术检查确诊。诊断符合1986年FAB协作组的MIC诊断标准及分型标准、急性髓系白血病（AML）WHO分型（2001）/FAB分类法和WHO对急性淋巴细胞白血病（ALL）分型的修订（2001）。初发AML 23例（M1 3例，M2 6例，M3 4例，M4 5例，M5 5例），慢性粒细胞白血病（CML) 4例（慢性期3例，急变期1例），ALL 5例（T细胞型1例，B细胞型4例），慢性淋巴细胞白血病（CLL) 3例。完全缓解后急性白血病5例（AML 3例，ALL 2例）。选择同期我科门诊及住院的缺铁性贫血患者20例为对照组，其中男7例，女13例，年龄15~ 77岁，中位年龄47岁。本研究遵循的程序符合我院伦理委员会所制定的伦理学标准。
TF、uPAR、HPA及内参GAPDH引物均由北京三博远志公司合成。二步法RT-PCR试剂盒（BSB05M1）购于杭州博日公司。淋巴细胞分离液、琼脂糖、焦碳酸二乙酯（DEPC）、溴化乙锭（EB）、TAE缓冲液、氯仿、TRIzol、异丙醇、无水乙醇等购于上海生工公司及杭州博日公司。局部无菌操作进行骨髓穿刺，用无菌注射器抽取骨髓液2 ml，以5% EDTA干粉管抗凝。
分离骨髓液中的单个核细胞，按TRIzol RNA提取试剂盒说明提取总RNA，检测样本RNA的纯度。所得RNA合成模板cDNA，如下配比反应体系：5× RT Buffer 2 μl，dNTP 1 μl，Oligo-dT 0.5 μl，RNase inhibitor 0.5 μl，AMV反转录酶0.5 μl，RNA 5 μl，RNase free H2O 0.5 μl，总体积10 μl，混合后经37 ℃ 45 min与95 ℃ 5 min反转录为cDNA。PCR扩增目的基因，引物序列根据GenBank公布的cDNA序列设计。HPA的引物序列为：5'-TTCGATCCCAAGAAGGA ATCAAC-3'（正义链）和5'-GATGTGATGCCATGTAA CTGAATC-3'（反义链），退火温度为54~ 60 ℃，PCR产物为538 bp。TF的引物序列为：5'-GAAGCAGAC GTACTTGGCACGG-3'（正义链）和5'-CCGAGGTTTG TCTCCAGGTA-3'（反义链），退火温度为58 ℃，PCR产物为121 bp。uPAR的引物序列为：5'-CAGCCTCA CCATCACCCT-3'（正义链）和5'-ACAACAGCGGCAA CAATA-3'（反义链），退火温度为52~ 58 ℃，PCR产物为307 bp。以GAPDH为内参照，引物序列为：5'-G ATGACAAGAAGGTGGTGAAG-3'（正义链）和5'-GTC TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3'（反义链），扩增片段为246 bp。PCR体系为25 μl：10 × PCR Buffer 2.5 μl，dNTP 0.5 μl，目的基因或内参照上游及下游引物各0.5 μl，Taq mix DNA聚合酶0.5 μl，cDNA模板2.5 μl，无菌去离子水补至25 μl。反应条件：热启动94 ℃ 5 min之后，94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 30个循环，最后72 ℃ 10 min结束反应。获得的产物经琼脂糖凝胶电泳后，于紫外分光光度仪下观察，以PCR Marker的位置判断目的产物。拍照后进行面积灰度扫描，以密度代表其表达量，计算出目的基因的相对表达量。
目的基因相对表达量=目的基因的密度／GAPDH的密度
所有数据均经SPSS 11.5统计软件处理，计量资料采用均数±标准差（
±s）表示，两组间比较用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
白血病患者按类型分为五组：初发白血病35例中，AML 23例，CML 4例，ALL 5例，CLL 3例；缓解后急性白血病5例。研究组骨髓中单个核细胞TF、uPAR、HPA mRNA的表达与对照组相比均升高（均P<0.05）（表1、图1）。初发白血病中AML组骨髓中单个核细胞TF、uPAR、HPA mRNA高于CML组、CLL组、ALL组（TF：t值分别为2.355、2.301、2.412，P值分别为0.027、0.032、0.023；uPAR：t值分别为2.609、2.178、2.403，P值分别为0.018、0.039、0.025；HPA：t值分别为2.435、2.512、2.317，P值分别为0.021、0.019、0.033）。
各类型白血病患者骨髓中单个核细胞表面TF、uPAR、HPA mRNA表达水平与对照组比较（
±s）
各类型白血病患者骨髓中单个核细胞表面TF、uPAR、HPA mRNA表达水平与对照组比较（±s）
| 组别 | 例数 | TF | t值a | P值a | uPAR | t值a | P值a | HPA | t值a | P值a |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 20 | 0.66±0.03 | 0.53±0.02 | 0.81±0.02 | ||||||
| AML组 | 23 | 2.56±0.37 | 2.961 | 0.005 | 1.89±0.26 | 2.798 | 0.008 | 2.37±0.24 | 2.815 | 0.007 |
| CML组 | 4 | 1.33±0.06 | 2.323 | 0.031 | 0.92±0.15 | 2.274 | 0.037 | 1.42±0.13 | 2.372 | 0.029 |
| ALL组 | 5 | 1.93±0.08 | 2.935 | 0.007 | 1.44±0.01 | 2.406 | 0.021 | 1.68±0.09 | 2.318 | 0.033 |
| CLL组 | 3 | 1.23±0.07 | 2.492 | 0.024 | 1.19±0.16 | 2.177 | 0.041 | 1.54±0.12 | 2.407 | 0.028 |
注：TF为组织因子；uPAR为尿激酶型纤溶酶原激活物受体；HPA为乙酰肝素酶；AML为急性髓系白血病；ALL为急性淋巴细胞白血病；CML为慢性粒细胞白血病；CLL为慢性淋巴细胞白血病；a与对照组相比
TF：组织因子；uPAR：尿激酶型纤溶酶原激活物受体；HPA：乙酰肝素酶
白血病患者存在止血紊乱，可能是由血浆止血和白血病细胞表面止血状态联合决定的。内皮细胞和血小板来源的微粒等也促进了凝血紊乱。白血病细胞表面止血平衡研究近年来备受关注。我们前期采用流式细胞术检测白血病患者骨髓中白血病细胞表面TF、uPAR、HPA、组织因子途径抑制物（TFPI）的表达，发现TF、uPAR、HPA表达较高，且白血病组与对照组的表达存在差异[3]。本研究采用RT-PCR法从基因水平进一步检测TF、uPAR、HPA mRNA的表达水平，旨在研究不同类型白血病细胞止血平衡改变及其与临床血栓、出血的相关性，为临床治疗提供理论依据。
细胞表面具有促凝作用的蛋白包括TF、蛋白酶激活受体-1(PAR-1）、HPA。有抗凝或纤溶作用的细胞表面蛋白包括TFPI、uPAR和膜黏蛋白（Annexin）。目前已有研究对白血病细胞表面止血指标表达进行了分析。其中，评价TF在白血病细胞表面表达的研究较多，包括不同细胞株及患者白血病细胞表达的研究。有研究单独评价了TF在白血病细胞表面的表达，也有研究同时检测了TF与其他细胞表面标志[4,5,6]。有研究表明TF与肿瘤高凝状态及血管平滑肌细胞的增殖和移行能力有关，能提高肿瘤侵袭和转移能力[7]。而本研究涵盖的因子相对较全面，其中HPA为最新的研究热点，国内尚鲜见其与白血病的相关研究。
HPA是近年来发现的一类在局部能裂解硫酸乙酰肝素（HS）侧链的糖苷内切酶，其活化与肿瘤生长、血管新生、炎症和自身免疫相关[8]。许多恶性肿瘤HPA表达增高，并参与肿瘤浸润、转移的过程[9]。其主要通过破坏基底膜和细胞外基质完整性降低细胞间质的屏障功能，促进肿瘤细胞侵袭和转移[10]。本研究从白血病细胞表面止血平衡角度探讨了HPA及其相关因子的表达情况。最近研究显示，HPA与TF、TFPI及尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）可相互作用，从而影响止血系统[11,12,13,14,15,16]。HPA上调TF表达[12,13]，在细胞表面与TFPI相互作用，导致TFPI从细胞膜脱落，增加细胞表面凝血活性[14]。HPA可释放结合在HS侧链上的uPA[15,16]，可能影响细胞纤溶活性。
我们前期通过流式细胞术测定了不同类型白血病患者骨髓中白血病细胞表面TF、uPAR、HPA、TFPI这四种影响出凝血功能蛋白的表达情况，结果与Nadir等[4]的研究结果相似，TF、uPAR、HPA在白血病细胞表面表达高于对照组，TFPI在白血病及对照组间的表达未见明显区别。国外研究进一步提示不同类型白血病细胞表面TF、uPAR、AnnexinⅡ表达仍有不同。我们前期的流式细胞术结果显示，AML组白血病细胞表面TF、uPAR、HPA表达高于ALL组、CML组、CLL组。本研究在基因水平分析TF、uPAR、HPA mRNA的表达，同样得出了与国内外研究大致相同的结果，研究组TF、uPAR、HPA mRNA均高于对照组，且在AML中表达更明显。国内刘艳慧等[17]研究了白血病细胞中uPAR、AnnexinⅡ这两种出凝血蛋白的表达情况，结果表明M3、M5患者骨髓单个核细胞表面AnnexinⅡ及其mRNA的表达均高于对照及其他类型急性白血病，而uPAR的表达在AML的M4、M5中最高，M3次之。ALL患者骨髓单个核细胞uPAR、AnnexinⅡ mRNA的表达较低。他们还进一步证实，这与M3、AML、ALL患者血浆纤溶指标的变化一致，分析得出急性白血病纤溶异常激活与其细胞表面高表达uPAR、AnnexinⅡ有关。
本研究结果初步显示，白血病细胞HPA表达增加提示白血病细胞存在HPA活化，可能与白血病患者出凝血临床症状有相关性。同时也显示，白血病细胞表面促凝蛋白TF及抗凝或纤溶蛋白uPAR在不同类型白血病中表达不同。我们通过临床观察发现白血病患者体内TF、uPAR、HPA的表达与D-二聚体、纤维蛋白原水平有相关性。发现TF、HPA表达高的患者体内D-二聚体含量亦高，所以推测TF、HPA活化体内凝血系统，促进白血病患者临床血栓事件的发生。uPAR与体内纤维蛋白原含量有一定相关性，同样证实了其对患者体内纤溶活性的影响，促进白血病患者临床出血事件的发生。以上内容还需更多病例分析验证。而HPA及其相关蛋白表达是否与实体肿瘤相似，与白血病的复发、浸润是否有关联，还在进一步观察中。
综上所述，在白血病发病过程中，白血病细胞表面存在止血平衡改变；不同类型白血病或白血病发病的不同阶段止血平衡改变表现不同；白血病细胞表面止血平衡改变可能部分影响白血病患者临床出血或血栓形成。目前的研究，尤其是临床研究存在一定局限性。首先，病例数较少，对统计学结果有影响；其次，标本保存时间不一，可能会影响细胞表面凝血标志物的表达；再次，最明显的细胞表面凝血标志通常表现在急性早幼粒细胞白血病，其他类型白血病可能还有另外的发病机制。今后，应行大样本、多中心研究，统一试验步骤，尽可能对细胞表面标志行联合检测；同时，从不同角度进行止血平衡研究，以明确白血病及不同类型白血病的止血紊乱机制。可以采用更为先进的研究方法，如实时荧光定量PCR法，并从蛋白水平进一步测定TF、uPAR、HPA的表达情况。
