探讨冬凌草甲素联合地塞米松对多发性骨髓瘤U266细胞增殖与凋亡的影响及其相关分子机制。
培养U266细胞至对数生长期，分别采用高、中、低浓度的地塞米松、冬凌草甲素单独或联合处理U266细胞，以二甲基亚砜(DMSO)处理为对照，于处理后24、48、72 h利用CCK-8法检测细胞增殖情况；应用Annexin V-FITC/PI标记及流式细胞术检测细胞凋亡；利用实时荧光定量PCR法检测细胞Notch1、NF-κB/p65、bcl-2基因表达水平的变化；Western blot法分析Notch1、cleaved Notch1、NF-κB/p65、bcl-2蛋白表达水平的变化。
与对照组相比，不同剂量的药物处理组均能有效抑制U266细胞的增殖并促进其凋亡(P<0.05)，两种药物联合应用对U266细胞的抑制增殖和诱导凋亡具有协同作用(P<0.05)。U266细胞经地塞米松处理后其NF-κB/p65、bcl-2 mRNA和蛋白表达水平均有所下调(P<0.05)，冬凌草甲素处理组及联合处理组U266细胞Notch1、cleaved Notch1、NF-κB/p65、bcl-2蛋白表达水平均显著下调(P<0.05)。
冬凌草甲素联合地塞米松对U266细胞增殖的抑制作用及凋亡诱导作用显著增强，其作用机制可能与抑制Notch1信号通路有关。
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多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种血液系统恶性肿瘤，是以单克隆免疫球蛋白增高及多发性溶骨性病变为主要特征的恶性浆细胞克隆性增生疾病，占血液系统恶性肿瘤的10%，占所有恶性肿瘤的1%，其在欧美国家常见血液系统恶性肿瘤中仅次于非霍奇金淋巴瘤[1]。MM在我国的发病率为1/10万～2/10万，已经超过急性白血病，居血液系统恶性肿瘤发病率的第二位。随着当前我国人口老龄化程度日益加剧，MM发病率明显上升，此外，近年来MM发病出现了年轻化趋势，值得高度警惕[2]。本研究选择人骨髓瘤细胞株U266，通过体外实验观察冬凌草甲素与地塞米松是否对U266细胞的抑制增殖及促凋亡具有协同增强作用，并从分子水平探讨相关作用机制，为探索MM的治疗新方法提供理论依据。
人MM细胞株U266(上海拜力生物科技有限公司)，冬凌草甲素、地塞米松(上海国药集团化学试剂有限公司)，RPMI 1640培养液、胎牛血清(美国Life Technologist公司)，二甲基亚砜(DMSO)(美国Amresco公司)，CCK-8试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(美国BD公司)，QIAzol Lysis Reagent(德国Qiagen公司)，cDNA合成试剂和荧光定量PCR试剂(美国Promega公司)，Western blot实验用相关抗体(英国BioVision公司)。
U266细胞在含有10％灭活胎牛血清、青霉素(100 U/ml)、链霉素(0.1 mg/ml)的RPMI 1640培养液中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，根据细胞生长状况，2~ 3 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。按每种药物浓度为一组，每组设3个平行孔，按以下实验设计给药，(1)地塞米松单独处理组：0.1、1、10 μmol/L；(2)冬凌草甲素单独处理组：5、10、20 μmol/L；(3)联合处理组：0.1 μmol/L地塞米松＋5 μmol/L冬凌草甲素，1 μmol/L地塞米松+ 10 μmol/L冬凌草甲素，10 μ mol/L地塞米松+ 20 μmol/L冬凌草甲素；另设阴性对照组：加入等量含有0.1 % DMSO的培养液。
取对数生长期的U266细胞，调整细胞密度为1.5×105/ml，接种于96孔板，每孔100 μl，培养24 h待细胞贴壁后，更换培养液，按分组处理细胞。细胞置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，分别于给药后24、48、72 h将各组U266细胞取出，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT，培养4 h后取出，每孔加入DMSO 100 μl，摇床低速振荡10 min，显微镜下观察着色颗粒消失后，读取570 nm处吸光度(A)值，根据公式计算细胞增殖抑制率。
细胞增殖抑制率＝(对照组A值-实验组A值)／对照组A值×100%
取对数生长期的U266细胞，调整细胞密度为2.5×105/ml，接种于6孔板，每孔体积为4 ml，按细胞分组，药物处理剂量采用中等剂量，在药物处理后各时间点离心收集细胞，调整总细胞数(0.5~ 1.0)×10个／管，800×g离心5 min，弃培养液。用冷PBS洗涤细胞2次，800×g离心10 min，弃上清，收集细胞。将细胞悬浮于200 μl Binding Buffer中，加入5 μl Annexin V-FITC染色液和5 μl PI染色液，室温避光反应15 min后加入300 μl Binding Buffer，在1 h内用流式细胞仪检测。实验独立重复3次。
中剂量药物处理48 h后收集各组细胞，按照试剂盒操作说明书提取细胞总RNA，并用分光光度计测定其浓度。根据cDNA合成试剂盒操作说明将RNA反转录为cDNA。以此cDNA为模板，以β-actin基因为内参，实时荧光定量PCR检测目的基因的表达情况。Notch1上游引物：5'-TCCTCCTCTTCCTCG CTGTT-3'，下游引物：5-TTGTCTTCGTGTTTCCGCC-3'，片段长度490 bp；NF-κB/p65上游引物：5'-CTGAACCAGGGCATACCTGT-3'，下游引物：5'-GAGA AGTCCATGTCCGCAAT-3'，片段长度197 bp；bcl-2上游引物：5'-GGTGCCACCTGTGGTCCACCTG-3'，下游引物：5'-CTTCACTTGTGGCCCAGATAGG-3'，片段长度459 bp；β-actin上游引物：5'-CCTCTGACTTCAACA GCGACAC-3'，下游引物：5'-TGGTCCAGGGGTCTTAC TCC-3'；片段长度174 bp. PCR体系：SYBR Go Taq qPCR Master Mix 2 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各0.4 μl，补dH2O至20 μl；反应条件：95 ℃预变性15 min, 95 ℃变性15 s，56 ℃退火60 s，共40个循环。反应后对数据进行相对定量分析，用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。实验独立重复3次。
中剂量药物处理48 h后收集各组细胞，PBS洗涤后，用含PMSF的细胞裂解液裂解细胞并提取总蛋白，用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度。每组取30~ 50 μg样品进行SDS-PAGE电泳并转至PVDF膜，用含5％脱脂奶粉的PBS封闭2 h，分别用兔抗Notch1、兔抗cleaved Notch1、兔抗NF-κB/p65、兔抗bcl-2抗体于4 ℃反应过夜，次日用TBST洗膜3次，每次10 min，再用辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔lgG二抗室温作用1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，DAB显色后曝光，利用凝胶成像及图像分析系统对Western blot图像进行分析，得到条带的灰度值，将各目标蛋白与内参β-actin条带灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。
采用SPSS 16.0软件对实验数据进行统计学分析，定量资料均符合正态分布，以均数±标准差(
±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
冬凌草甲素、地塞米松单独或联合作用24、48、72 h后，U266细胞增殖均受到明显抑制，与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。不同剂量的药物在相同时间对细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性趋势，相同处理方式对细胞增殖的抑制作用也呈现时间依赖性。相同作用时间联合药物处理组对细胞增殖的抑制作用均高于两药单独处理组(P<0.05)(图1)，1 μmol/L地塞米松+10 μmol/L冬凌草甲素组、1 μmol/L地塞米松单独处理组、10 μmol/L冬凌草甲素单独处理组72 h的细胞增殖抑制率分别为(74.22±5.12)%、(50.01±2.87)％和(56.74±3.26)%(P=0.005 2)。提示冬凌草甲素和地塞米松对U266细胞的生长有显著抑制效应。
1: 0.1 μmol/L Dex; 2: 1 μmol/L Dex; 3: 10 μmol/L Dex; 4：5 μmol/L Ori；5：10 μmol/L Ori; 6: 20 μmol/L Ori; 7: 0.1 μmol/L Dex+5 μmol/L Ori; 8: 1 μmol/L Dex+10 μmol/L Ori；9: 10 μmol/L Dex+20 μmol/L Ori
与阴性对照组相比，1 μ mol/L地塞米松+ 10 μmol/L冬凌草甲素组、1 μmol/L地塞米松单独处理组、10 μmol/L冬凌草甲素单独处理组24、48、72 h U266细胞凋亡率明显增高(P=0.018)，且均以早期凋亡为主，凋亡率呈时间依赖性。相同作用时间联合组较单独处理组细胞的凋亡率明显提高(P<0.05)，提示两药联合具有协同促凋亡作用(表1，图2)。鉴于中剂量处理组48 h即能有效抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，因此选择此浓度药物处理细胞进行后续实验。
冬凌草甲素、地塞米松处理不同时间后多发性骨髓瘤U266细胞凋亡率比较(%,
±s)
冬凌草甲素、地塞米松处理不同时间后多发性骨髓瘤U266细胞凋亡率比较(%,±s)
| 组别 | 样本数 | 24 h | 48 h | 72 h | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 早期凋亡率 | 总凋亡率 | 早期凋亡率 | 总凋亡率 | 早期凋亡率 | 总凋亡率 | ||
| 阴性对照组 | 3 | 6.15±0.86 | 6.94±1.63 | 8.65±2.89 | 14.98±3.52 | 16.24±2.42 | 25.68± 3.69 |
| 地塞米松组 | 3 | 11.15±1.64a | 12.01±2.87a | 22.03±2.89ab | 27.43±3.97ab | 35.21±2.42ab | 41.30±44.69ab |
| 冬凌草甲素组 | 3 | 11.16±2.86a | 12.85±3.03a | 18.65±3.13ab | 20.34±3.43ab | 33.41±3.21ab | 43.11± 4.15ab |
| 冬凌草甲素+地塞米松组 | 3 | 28.84±2.56ab | 43.17±4.45a | 52.08±4.02abcd | 63.40±3.92abcd | 62.30±3.41abcd | 78.02± 3.83abcd |
注：与相同时间阴性对照组比较,aP<0.05；与同组前一时间点比较,bP<0.05；与相同时间地塞米松组比较,cP<0.05；与相同时间冬凌草甲素组比较,dP<0.05
药物作用48 h后，与阴性对照组相比，1 μmol/L地塞米松组NF-κB/p65、bcl-2 mRNA的表达水平均下调(1.90±0.16比2.50±0.30，2.20±0.20比2.80± 0.31)，差异均有统计学意义(P=0.002 3, P=0.004 8)，Notch1 mRNA水平没有明显变化(3.10±0.30比3.20±0.41，P=0.07)。10 μmol/L冬凌草甲素组和1 μmol/L地塞米松+10 μmol/L冬凌草甲素组NF-κB/p65、bcl-2、Notch1 mRNA的表达水平均较阴性对照组降低(P<0.05)，联合处理组均低于单独用药组(P< 0.05)，其中，阴性对照组NF-κB/p65、bcl-2、Notch1 mRNA相对表达量分别为2.50 ± 0.30、2.80 ± 0.31、3.20±0.41，冬凌草甲素组分别为1.93±0.20、1.88± 0.12、2.33 ± 0.28，地塞米松＋冬凌草甲素组分别为0.80±0.01、0.50±0.07、0.85±0.20(图3)。
DMSO：二甲基亚砜(阴性对照组)；aP<0.05
作用48 h后，与阴性对照组相比，1 μmol/L地塞米松组，除Notch1外，NF-κB/p65、bcl-2蛋白的表达水平明显下降(P<0.05)，10 μmol/L冬凌草甲素组和1 μmol/L地塞米松＋10 μmol/L冬凌草甲素组的Notch1、cleaved Notch1、NF-κB/p65、bcl-2蛋白表达水平均下调(P<0.05)。同时，联合处理组Notch1、cleaved Notch1、NF-κB/p65、bcl-2蛋白表达水平的下调作用最明显(图4)。可以初步证实冬凌草甲素可以下调U266细胞Notch1/NF-κB信号分子蛋白的表达水平，冬凌草甲素联合地塞米松的作用更加明显。
DMSO：二甲基亚砜(阴性对照组)
数十年来，MM的治疗一直采用激素和细胞毒性药物联合方案，但是由于骨髓瘤细胞的增殖比例低及对多种药物耐药的形成，耐药问题已经成为治疗MM的难题之一。尽管近年来应用抑制血管新生药物(沙利度胺)、自体骨髓移植治疗，特别是蛋白酶体抑制剂靶向药物(注射用硼替佐米)的出现，使很多难治性MM患者取得了较好的治疗效果。但沙利度胺治疗产生的较明显的不良反应以及造血干细胞移植的高相关病死率限制了它们的扩大应用，而蛋白酶体抑制剂则价格昂贵，且在临床上已经出现了耐药现象，MM的治疗现状不容乐观[3,4,5]。由于MM本身发病机制的复杂性和多药耐药的形成，目前MM仍是一种无法彻底治愈的疾病，特别是复发、难治MM的治疗仍然是一个重大挑战。深入研究MM发病机制并寻找新的高效低毒的抗肿瘤药物或有化疗增敏作用的药物，以拓宽MM治疗途径具有重要意义。
植物提取物因其不良反应小、作用独特、研究成本低等诸多特点成为近年来抗肿瘤药物的研究热点[6]。冬凌草甲素是冬凌草的主要有效成分，为对映-贝壳杉烷型二萜化合物。大量研究表明冬凌草甲素对一系列不同来源的肿瘤细胞如骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、急性白血病、多形性恶性胶质瘤以及人黑素瘤细胞具有诱导细胞凋亡和抑制增殖作用，其中一些初步的分子机制也得到了阐明，提示其是一个较好的抗肿瘤候选药物之一[7,8,9]。还有研究表明其可以增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，如可提高吉西他滨、伊马替尼、三氧化二砷等药物对肿瘤细胞的促凋亡作用[10,11,12]。
地塞米松是糖皮质激素的一种衍生物，众多基础研究和临床研究表明地塞米松对包括MM在内的多种血液系统肿瘤细胞具有抑制生长和诱导凋亡的作用，并被广泛应用于MM的临床治疗，也是MM化疗方案的重要组成部分[5]。其标准用法均为大剂量使用，而大剂量激素的使用带来的严重不良反应往往导致患者无法坚持治疗，此外地塞米松耐药的产生也一定程度上影响了其应用[5]。近年来中医药联合化学药物用于抗肿瘤研究受到研究者的极大关注，如有研究表明中药雷公藤内酯醇可以有效提高耐地塞米松的骨髓瘤细胞株对地塞米松及蛋白酶体抑制剂的敏感性[13]。
目前鲜见冬凌草甲素联合地塞米松用于抗肿瘤的报道。本研究以U266细胞为模型，观察地塞米松、冬凌草甲素单独处理和联合处理后U266细胞增殖与凋亡情况，发现各药物处理组均能有效抑制细胞增殖并促进细胞凋亡，进一步验证了冬凌草甲素对骨髓瘤细胞的增殖抑制和凋亡促进效应，并具有时间和剂量依赖效应，与其他相关研究报道一致[9]。本研究进一步分析发现冬凌草甲素和地塞米松联合处理组可以更加有效地发挥抗肿瘤效应，这为将来临床应用冬凌草甲素或地塞米松治疗MM提供了参考。
Notch信号通路是广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物并在进化上高度保守的一种信号通路，它参与调控细胞的多种活动，如细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡等[14]。Notch1是Notch基因家族的成员之一，其在肿瘤形成中起重要作用[15]。有研究证实MM患者肿瘤细胞和骨髓瘤细胞株中大量表达Notch1配体，激活的Notch信号通路可促进骨髓瘤细胞的生长，抑制骨髓瘤细胞的凋亡，而抑制Notch信号通路能诱导骨髓瘤细胞的凋亡，增强化疗药物的细胞毒作用[16,17,18]。因此，Notch也成为了MM治疗策略的重要研究靶点。Hu等[17]利用NRSP抑制剂GSI处理人骨髓瘤RPMI 8226细胞，发现可以有效抑制RPMI 8226细胞的增殖，同时下调NRSP相关分子的表达。
在Notch1信号通路中，Notch1一旦与配体结合，就会发生蛋白水解，释放出胞内区，即cleaved Notch1进入细胞核，与转录因子相互作用，进而调控靶基因的转录[14]。NF-κB家族是Notch1信号通路的一个靶基因之一，而NF-κB也是调控细胞凋亡和增殖的重要调节因子，它可通过诱导和上调抗凋亡bcl-2家族蛋白的水平而发挥抑制凋亡作用[14,19]。冬凌草甲素是否可以通过调控Notch1/NF-κB/凋亡相关的调控蛋白信号通路影响骨髓瘤细胞的增殖和凋亡目前鲜见相关报道。最近有研究表明，冬凌草甲素可通过阻断Notch信号通路介导抗血管新生，从而影响肿瘤细胞生长与转移，提示冬凌草甲素可以直接作用于Notch信号通路中的相关分子，介导下游效应[20]。本研究发现，利用冬凌草甲素单独或冬凌草甲素联合地塞米松处理U266细胞后，细胞Notch1、NF-κB/p65以及bcl-2的mRNA和蛋白表达水平均显著下调，此外，Notch蛋白的活化形式cleaved Notch1的表达水平也有显著下调，提示冬凌草甲素可能会通过靶向抑制Notch1分子并调控NF-κB/bcl-2细胞凋亡通路，产生凋亡促进作用。鉴于调控细胞凋亡信号网络的复杂性，为进一步阐明Notch1通路在冬凌草甲素介导的促进U266细胞凋亡过程中的作用机制，还需对Notch1通路相关蛋白如Hes-1、cyclin D1、c-myc的表达情况进行研究，进一步延伸到体内实验。
总之，本研究通过体外实验进一步证实了冬凌草甲素对MM的抗肿瘤效果，冬凌草甲素联合地塞米松能够达到更好的干预效果，对Notch1分子及其信号通路的抑制作用可能是其发挥作用的机制之一，这一结论可为将来临床应用冬凌草甲素治疗MM提供理论依据。
利益冲突 无
