研究地西他滨（DAC）对人急性髓系白血病细胞株HL-60体外生长及自然杀伤（NK）细胞活化性受体配体（NKG2DL）表达的调节作用，并探讨JAK-STAT3-SOCS信号通路相关的分子机制。
CCK-8法检测DAC对HL-60细胞增殖活性的影响，Annexin-V/PI双标法检测细胞凋亡，流式细胞术检测HL-60细胞表面NKG2DL分子MICA/B、ULBP的表达，羧基荧光素双乙酸盐（CFSE）法检测NK细胞的杀伤活性，蛋白印迹法分析细胞内JAK-STAT3通路中STAT3、STAT3上游激酶JAK1、JAK2及STAT3活性负调控因子细胞因子信号抑制物（SOCS）-1、SOCS-3的蛋白表达水平，甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析（MS-HRM）检测DAC处理后SOCS-1、SOCS-3基因甲基化程度。
DAC可抑制HL-60细胞活性：0.2、0.5和1.0 μmol/L DAC处理48 h，HL-60细胞活性较对照组分别下降（25±11）%、（39±8）%和（50±7）%（P<0.01）；48 h时，细胞凋亡发生率分别为（24.77±7.50）%、（27.10±4.48）%和（30.53±3.93）%，均较对照组细胞的（3.11±0.50）%增加（P<0.01）。DAC可诱导HL-60细胞表面MICA/B、ULBP-1及ULBP-3分子的表达增高，增强HL-60细胞对NK细胞的杀伤敏感性。DAC处理后HL-60细胞内STAT3、JAK1、JAK2及p-STAT3、p-JAK1、p-JAK2表达下降，SOCS-1和SOCS-3蛋白表达增高。DAC可抑制SOCS-3基因甲基化。
DAC抑制人急性髓系白血病细胞株HL-60增殖，上调HL-60细胞对NKG2DL的表达，增强NK细胞对其的杀伤活性，其机制可能与细胞内JAK-STAT3-SOCS信号通路的活性调控有关。
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地西他滨（decitabine，DAC）是一种新型的表观遗传学药物，通过抑制细胞内DNA甲基化转移酶的活性，关闭细胞中高度活化的甲基化癌基因，并激活某些因甲基化而沉默的抑癌基因，阻止肿瘤细胞的生长[1,2]。自2006年获得美国食品药品管理局（FDA）批准上市以来，DAC对成年人急性白血病和多发性骨髓瘤有良好疗效。小剂量DAC（20 mg·m-2·d-1）治疗3个疗程，可使47%的急性髓系白血病（AML）患者达到完全缓解，患者的总体生存时间和无病生存时间都较治疗前明显延长[3,4]。本研究观察了DAC对人AML细胞株HL-60的体外生长及自然杀伤（NK）细胞活化性受体（NKG2D）配体（NKG2DL）表达的调节作用，并探讨JAK-STAT3-SOCS信号通路相关的分子机制。
HL-60细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，以含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及链霉素的RPMI 1640培养液培养。NK92细胞（人NK细胞株）为台北新光吴火狮医院季匡华教授惠赠，以含12.5%胎牛血清、12.5%马血清、100 U/ml白细胞介素（IL）-2、100 U/ml青霉素及链霉素的α-低限基本培养液（α-MEM），于37 ℃、5%培养箱中培养。DAC（江苏正大天晴药业股份有限公司）以二甲基亚砜（DMSO）配成10 mmol/L储存液，0.22 μmol/L滤膜过滤除菌后，-20 ℃保存备用。胎牛血清、马血清、细胞培养液（RPMI 1640、α-MEM）为美国Gibco公司产品。抗NKG2DL抗体（抗PE-MICA/B、PE-ULBP-1、APC-ULBP-2、PE-ULBP-3荧光标记抗体）及PE、APC标记同型对照IgG1购自美国R&D System公司。流式细胞仪为美国BD公司产品（BD Biosciences FACSCalibur）。BCA蛋白质定量试剂盒（BCA Protein Assay Kit，71285-3）购自美国默克化工技术（上海）公司。STAT3、p-STAT3、JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、细胞因子信号抑制物（SOCS）-1、SOCS-3、β-actin为美国Cell Signaling Technology公司产品。化学发光Amersham ECL Plus Kit为美国GE Healthcare公司产品。细胞/组织基因组DNA提取试剂盒购自上海捷瑞生物科技有限公司；EpiTect Bisulfite Kit、甲基化标准品EpiTect PCR Control DNA Set购自德国Qiagen公司；甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析（MS-HRM）检测试剂SsoFast Eva Green Supermix购自美国Bio-Rad公司。
选取对数生长期的HL-60细胞，调整细胞密度为2×105/ml，接种于96孔板，100 μl/孔，加入DAC溶液使其终浓度分别为0.2、0.5、1.0 μmol/L，轻轻混匀后，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h或48 h，每孔加入10 μl CCK-8试剂，混匀后继续于37 ℃培养1~4 h。实验结束后于450 nm处检测吸光度（A）值（参比波长为600 nm）。实验同时设试剂空白孔（调零孔）和实验对照孔。试剂空白孔无HL-60细胞，加入同体积培养液和CCK-8试剂；实验对照孔含HL-60细胞，不加药物，细胞培养物中加入同体积磷酸盐缓冲液（PBS）。每组设3个复孔。计算细胞存活率，实验重复3次。
细胞存活率（%）=（加药细胞孔A450值-试剂空白孔A450值）/（实验对照孔A450值-试剂空白孔A450值）×100%
选取对数生长期的HL-60细胞，以含10% FBS的RPMI 1640培养液调整细胞密度为2×105/ml，接种于6孔板，2 ml/孔，加入DAC后使终浓度分别为0.2、0.5、1.0 μmol/L于37 ℃、5% CO2培养24 h或48 h后进行检测。实验对照为不加药物处理组。培养结束后收集各组细胞，以100 μl 1×Annexin binding buffer重悬，调整细胞密度为1×106/ml，各实验组和对照组细胞依次加入5 μl Annexin-V和1 μl PI工作液。避光室温培养15 min后，各管内加入400 μl 1 × Annexin binding buffer，混匀避光置于冰上，进行流式细胞术检测。实验重复3次。
收集DAC各浓度（0.2、0.5、1.0 μmol/L）处理组细胞和未加药对照组细胞，PBS洗涤1次后加入100 μl PBS，分别加入4 μl荧光素标记的抗人NKG2DL抗体（MICA/B、ULBP-1、ULBP-2和ULBP-3），4 ℃避光反应30 min，4 ℃预冷PBS洗2次，以100 μl PBS重悬细胞后，流式细胞术检测细胞表面荧光素标记抗体分子的表达，测定值以平均荧光强度（MFI）表示。同型IgG1抗体（BD/Pharmingen）为阴性对照。每个实验至少重复3次。
以人NK细胞株NK92为效应细胞，CFSE标记的HL-60细胞为靶细胞，检测NK细胞对DAC处理及未处理HL-60细胞的体外杀伤活性。CFSE标记方法：收集HL-60细胞，调整细胞密度为2×105/ml，加入CFSE（终浓度为5 μmol/L），轻轻吹打均匀后，置于37 ℃、5% CO2培养10 min；取出后加入5倍体积冷RPMI 1640培养液，轻轻混匀，4 ℃放置5 min。标记好的细胞以PBS洗3次，RPMI 1640培养液重悬细胞，调整细胞密度为2×105/ml，将效应细胞与靶细胞按不同效靶比（5∶1、10∶1）混合后，37 ℃、5% CO2培养4 h，收集细胞，PBS洗2次，加入5 μl PI（50 μg/ml）混匀，室温避光培养15 min后，流式细胞术分析被NK细胞杀伤的HL-60细胞比例（CFSE+ PI+ HL-60）。同时设靶细胞对照孔、效应细胞对照孔和培养液空白对照孔，每组3个复孔。实验重复3次。
选择生长状态良好的HL-60细胞，调整细胞密度为5×105个/ml，加入DAC后使之终浓度分别为0.2、0.5、1.0 μmol/L，处理48 h，收集细胞，抽提胞内总蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法定量后，取20 μg总蛋白行10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），400 mA下电转移120 min；转膜、封闭后，分别与抗SOCS-1、SOCS-3、p-JAK、p-STAT3、β-actin等抗体培养，再与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗作用，ECL显色、X线胶片曝光后，Image J软件扫描灰度定量。实验重复3次。
根据DNA提取试剂盒操作方法提取HL-60细胞中的DNA。亚硫酸盐修饰按照EpiTect Bisulfite Kit说明书操作。修饰后的DNA采用MS-HRM检测甲基化水平。SOCS-1上游引物：5'-AGGAGAGGATAGGGTTT TGTTTT-3'，下游引物：5'-ACCCTATTTCCCTCTCTTCT AAAC-3'；SOCS-3上游引物：5'-GTTTTAAGATTTTTAG TTTTAAGAG-3'，下游引物：5'-TCTTAATCCCAAACTA AATCTTAAC-3'。qPCR反应在95 ℃热启动5 min，然后95 ℃ 20 s，65 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共进行40个循环，熔解曲线65~95 ℃。实验重复3次。
采用SPSS 16.0软件进行数据处理，数据以均数±标准差（
±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
不同浓度DAC处理HL-60细胞后，细胞增殖受到抑制，同时HL-60细胞出现早期凋亡。CCK-8法结果显示，0.2、0.5及1.0 μmol/L DAC作用24 h，细胞增殖未见明显抑制；处理48 h各组细胞活性较对照组分别下降（25±11）%、（39±8）%和（50±7）%（P<0.05），抑制效应具有剂量依赖性（表1）。
不同浓度地西他滨（DAC）作用不同时间对人急性髓系白血病细胞株HL-60细胞存活率的影响（%，
±s）
不同浓度地西他滨（DAC）作用不同时间对人急性髓系白血病细胞株HL-60细胞存活率的影响（%，±s）
| DAC浓度（μmol/L） | 样本数 | 细胞存活率 | |
|---|---|---|---|
| 24 h | 48 h | ||
| 0（对照组） | 3 | 100±12 | 100±4 |
| 0.2 | 3 | 99±9 | 75±11 |
| 0.5 | 3 | 83±12 | 61±8 |
| 1.0 | 3 | 82±11 | 50±7 |
| F值 | 2.37 | 18.27 | |
| P值 | 0.147 | 0.001 | |
DAC（0.2、0.5、1.0 μmol/L）处理24 h后细胞出现早期凋亡，处理48 h后细胞凋亡率明显增高，早期凋亡细胞百分率与对照组和24 h处理组相比差异有统计学意义（P<0.01），呈剂量依赖性（表2）。
不同浓度地西他滨（DAC）作用不同时间对人急性髓系白血病细胞株HL-60细胞凋亡率的影响（%，
±s）
不同浓度地西他滨（DAC）作用不同时间对人急性髓系白血病细胞株HL-60细胞凋亡率的影响（%，±s）
| DAC浓度（μmol/L） | 样本数 | 细胞凋亡率 | |
|---|---|---|---|
| 24 h | 48 h | ||
| 0（对照组） | 3 | 3.26±0.40 | 3.11±0.50 |
| 0.2 | 3 | 7.36±1.01 | 24.77±7.50 |
| 0.5 | 3 | 8.21±0.21 | 27.10±4.48 |
| 1.0 | 3 | 9.00±0.26 | 30.53±3.93 |
| F值 | 60.74 | 20.10 | |
| P值 | 0.000 | 0.000 | |
流式细胞术结果显示，DAC处理24 h细胞表面4种NKG2DL分子的表达水平无明显改变；低浓度DAC（0.2、0.5 μmol/L）处理48 h，ULBP-2表达水平无明显改变，高浓度DAC（1.0 μmol/L）处理后ULBP-2表达增高；不同浓度DAC处理48 h，MICA/B、ULBP-1和ULBP-3分子表达都较对照组表达有明显增高（图1，表3）。
不同浓度地西他滨（DAC）作用不同时间对人急性髓系白血病细胞株HL-60细胞NKG2DL表达的影响（平均荧光强度，
±s）
不同浓度地西他滨（DAC）作用不同时间对人急性髓系白血病细胞株HL-60细胞NKG2DL表达的影响（平均荧光强度，±s）
| DAC浓度（μmol/L） | 样本数 | MICA/B | ULBP-1 | ULBP-2 | ULBP-3 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 24 h | 48 h | 24 h | 48 h | 24 h | 48 h | 24 h | 48 h | ||
| 0（对照组） | 3 | 380±74 | 499±194 | 907±218 | 1 154±464 | 72±32 | 85±29 | 693±138 | 726±170 |
| 0.2 | 3 | 466±133 | 824±197 | 1 235±248 | 1 724±245 | 95±60 | 104±61 | 971±240 | 1 000±119 |
| 0.5 | 3 | 463±124 | 945±182 | 1 248±141 | 1 869±214 | 41±18 | 82±29 | 947±268 | 1 307±193 |
| 1.0 | 3 | 456±138 | 949±84 | 1 237±181 | 1 844±212 | 88±49 | 129±70 | 817±119 | 1 055±245 |
| F值 | 0.349 | 4.612 | 2.058 | 3.690 | 0.719 | 0.530 | 1.222 | 4.869 | |
| P值 | 0.791 | 0.037 | 0.184 | 0.062 | 0.568 | 0.674 | 0.363 | 0.033 | |
注：NKG2DL为自然杀伤细胞活化性受体配体
红色：IgG同型抗体对照；蓝色：HL-60同型抗体对照；棕色：0.2 μmol/L DAC；绿色：0.5 μmol/L DAC；粉色：1.0 μmol/L DAC
流式细胞术分析结果显示，效靶比为5∶1时，NK细胞对0.2、0.5及1.0 μmol/L DAC处理HL-60细胞的杀伤率均较对照组增高（P<0.05），随DAC处理浓度的增强，杀伤率也有增加；效靶比增加为10∶1时，细胞杀伤率无明显改变（表4）。
地西他滨（DAC）作用人急性髓系白血病细胞株HL-60细胞对自然杀伤（NK）细胞杀伤活性的影响（%，
±s）
地西他滨（DAC）作用人急性髓系白血病细胞株HL-60细胞对自然杀伤（NK）细胞杀伤活性的影响（%，±s）
| DAC浓度（μmol/L） | 样本数 | 细胞杀伤率 | |
|---|---|---|---|
| 效靶比5∶1 | 效靶比10∶1 | ||
| 0（对照组） | 3 | 6.7±2.7 | 9.3±2.2 |
| 0.2 | 3 | 17.9±4.4 | 18.2±7.8 |
| 0.5 | 3 | 21.4±6.9 | 22.3±8.9 |
| 1.0 | 3 | 24.7±5.6 | 26.7±12.0 |
| F值 | 6.980 | 2.277 | |
| P值 | 0.013 | 0.157 | |
蛋白印迹法结果显示，DAC作用48 h，HL-60细胞内JAK1、JAK2、STAT3蛋白表达均有下降，以p-JAK1、p-JAK2和p-STAT3（Ser727、Tyr705）分子的表达水平下降更为明显（图2A和图2B）；低浓度DAC（0.2、0.5 μmol/L）处理的HL-60细胞内SOCS-1和SOCS-3的表达均较未加药物处理的对照组明显增高，高浓度DAC（1.0 μmol/L）处理后则没有上述明显效应（图2C）。
2A：STAT3和p-STAT3（Tyr705和Ser727）蛋白表达结果；2B：JAK和p-JAK表达结果；2C：SOCS-1和SOCS-3蛋白的表达结果；对照组为DAC 0 μmol/L组
HL-60细胞内未发现有SOCS-1基因的甲基化改变，SOCS-3基因为高甲基化水平（甲基化水平为80%），DAC处理后SOCS-3基因的甲基化水平明显降低，且随着DAC浓度的增高SOCS-3基因的甲基化表达逐渐递减（图3）。
3A：甲基化标准曲线图（紫色：100%；绿色：80%；蓝色：30%；黄色：0）；3B：使用SOCS-1引物DNA分型结果；3C：使用SOCS-3引物DNA分型结果（紫色：对照组；绿色：0.2 μmol/L DAC；蓝色：0.5 μmol/L DAC；红色：1.0 μmol/L DAC）
AML是一种造血系统的恶性克隆性疾病。近年来研究发现，AML发病机制中除已明确的细胞遗传学因素外，也有表观遗传学异常参与其中。超过70%的AML患者有DNA甲基化或组蛋白修饰等表观遗传学异常改变[5]，而抑制DNA甲基化也成为治疗肿瘤的一个新的有效手段。
本研究结果表明，DAC对人AML细胞株HL-60体外生长具有明显抑制效应。进一步研究发现，DAC还可增加HL-60细胞表面NKG2DL分子的表达，进而增强NK细胞对其的杀伤活性。此外，DAC可显著抑制HL-60细胞内JAK-STAT3通路主要分子JAK、STAT3的磷酸化水平，上调STAT3负反馈调节因子SOCS-1、SOCS-3蛋白的表达，提示JAK-STAT3信号通路可能是DAC作用HL-60细胞的分子靶点。
正常情况下，STAT3可被快速而短暂地激活，持续激活的STAT3则与细胞异常增殖和恶性转化密切相关[6,7]。白血病细胞中常有STAT3的组成性激活[6]。SOCS是一种细胞因子信号转导负调控蛋白，对JAK-STAT3信号通路具有负反馈调节作用，可抑制细胞因子激活的STAT3信号通路。研究发现，JAK-STAT3通路持续活化的同时常伴SOCS表达下调[8,9]。
多个研究显示，SOCS的表达调节与其启动子区域CpG岛的甲基化状态有关。如SOCS-1基因的高甲基化失活可导致STAT3介导的信号通路异常激活，促进肿瘤的发生、发展[10,11,12]；而去甲基化药物可增加人胆管癌细胞中SOCS-3表达，进而抑制STAT3的磷酸化，诱导细胞凋亡[13]。本研究结果提示，DAC可显著抑制HL-60细胞JAK、STAT3的磷酸化水平，并上调SOCS-1、SOCS-3蛋白表达。我们推测作为一种甲基化酶抑制剂，DAC很可能是通过对SOCS基因的去甲基化修饰，激活SOCS表达，从而导致对磷酸化STAT3的抑制作用增强，进而介导对HL-60细胞的生长抑制作用。HRM实验结果则进一步证实DAC可能主要通过抑制SOCS-3而非SOCS-1基因的甲基化水平，诱导SOCS-3活化表达，进而抑制JAK、STAT3的磷酸化，发挥对HL-60细胞的生长抑制作用。
NK细胞是一种在机体抗肿瘤免疫监视中发挥重要作用的免疫效应细胞[14]，可在肿瘤发生初期通过表面活化性受体与肿瘤细胞表面的配体相结合介导杀伤作用。但AML细胞常有NKG2DL的低表达，从而导致NK细胞活化性信号的不足，使得细胞逃避NK细胞的免疫监视[15,16]，因此，上调NKG2D及其配体的表达水平，进而诱导NK细胞的杀伤活性，成为目前实施NK细胞介导的生物治疗的重要手段。
有研究发现，NK细胞受体及其配体分子的表达也受甲基化作用的调控。去甲基化药物可促进肿瘤细胞NKG2D配体MICB的表达上调，NK细胞的杀伤活性增强[17,18,19]。如低浓度DAC可增强人外周血NKG2D和NKp44的表达，促进NK细胞分泌干扰素（IFN）-γ和对靶细胞的杀伤作用[20,21]，但这些表观调控药物如何调控NK细胞相关免疫表型分子表达的机制并不清楚。
本研究中，我们发现DAC可增加HL-60细胞表面NKG2DL的表达，并增强NK细胞对其的杀伤活性。DAC的这一作用可能与STAT3的活性抑制也有关。Bedel等[22]的研究显示，NKG2DL分子MICA是STAT3调控的下游靶基因，STAT3可与MICA核内启动子区域特异性结合，调控后者的转录和表达。研究结果提示，作为细胞内一种重要的核转录因子，STAT3可能通过对NKG2DL基因的转录和表达调控参与NK细胞的活性调控。此前我们在慢性粒细胞白血病（CML）中的研究也发现，以携带STAT3 siRNA的慢病毒感染或以特异性的STAT3抑制剂处理K562细胞，均可明显增强细胞表面NKG2DL ULBP-2分子表达，证实ULBP-2的表达上调与STAT3活性抑制有关[23]。此外，DAC对HL-60细胞的诱导凋亡和NKG2DL表达上调作用都表现出一定的剂量相差效应，低浓度DAC（0.2、0.5 μmol/L）作用效应明显高于高浓度DAC（1.0 μmol/L）。高浓度DAC可抑制细胞DNA合成，诱导细胞死亡，对细胞具有较明显的细胞毒作用；低浓度DAC则可竞争性抑制细胞内胞嘧啶与DNA甲基化转移酶的共价结合，抑制DNA甲基化转移酶的活性，主要表现为去甲基化作用[24]。结合以上研究结果，DAC可能通过去甲基化作用促进HL-60细胞SOCS-1、SOCS-3表达增加，使得对STAT3磷酸化抑制作用增强，进而促进细胞凋亡及NKG2DL表达增加，STAT3可能是DAC作用的重要分子靶点。
综上所述，DAC可能通过对细胞内JAK-STAT3-SOCS-3信号通路的调控发挥抗白血病作用；此外，DAC增加细胞表面NKG2DL分子表达，进而增强NK细胞杀伤活性，这一作用也可能与DAC对上述信号通路的活性调控有关。DAC通过对HL-60细胞STAT3抑制因子SOCS-1和SOCS-3启动子的去甲基化作用诱导后者表达增加，增强其对JAK-STAT3信号通路的活性抑制，从而抑制AML细胞的增殖，并诱导细胞表面NKG2DL表达，增强NK细胞对其的识别和杀伤，这可能是DAC新的抗白血病作用分子机制。
利益冲突 无
