分析微小残留病阳性急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）患者免疫表型特征及其意义。
回顾性分析2014年6月至2016年1月天津金域医学检验所血液病诊断中心106例微小残留病阳性B-ALL患者流式细胞术检测的白血病相关免疫表型（LAIP），利用CD10、CD13/CD33、CD19、CD38、CD58、CD45等LAIP抗体进行B-ALL微小残留分析。
所有患者CD19均阳性；27例（25.4%）CD34阴性或者弱阳性；23例（21.7%）CD10阴性或者弱阳性，24例（22.6%）CD10强阳性，共47例（44.3%）CD10表达减低或增强；98例（92.5%）CD58强阳性；64例（60.4%）CD13/CD33阳性或弱阳性；33例（31.1%）CD38阴性或弱阳性；21例（19.8%）CD45阴性。15例（14.1%）6种LAIP同时阳性，30例（28.3%）5种LAIP同时阳性，42例（39.6%）4种LAIP同时阳性，13例（12.3%）3种LAIP同时阳性，5例（4.7%）2种LAIP同时阳性，1例（0.9%）1种LAIP阳性。
CD58、CD13/CD33、CD10、CD38、CD34抗原组合可以很好地区分肿瘤性原始/幼稚B淋巴细胞和正常B祖细胞，对于B-ALL微小残留病的判断有较高的准确性。
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急性淋巴细胞白血病（ALL）是常见的急性白血病之一，急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）是ALL中最常见的类型，约占儿童ALL的85%~90%和成年人ALL的75%[1,2]。随着诊断水平的不断提高，特别是危险度分层的建立及治疗方案的不断优化，ALL的缓解率和生存率有了明显提高，但仍有部分患者最终死于复发。ALL患者体内存在的微小残留病（MRD）是复发的根源，是判断危险度分层并及时调整治疗策略非常重要的指标。目前检测ALL MRD的方法主要是实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）及多参数流式细胞技术（MFC）[3,4]，其中RT-PCR已经被标准化并且认为是检测MRD的金标准[5]。但很多B-ALL患者肿瘤细胞并无相关的融合基因或由于种种原因未进行融合基因检测，且等位基因PCR未广泛应用到临床，所以MFC检测MRD是目前应用最广泛的技术，同时也是对PCR检测的补充。我们回顾性分析了106例MFC检测MRD阳性B-ALL患者抗原表达情况，探讨ALL残留的肿瘤细胞中白血病相关免疫表型（LAIP）的表达率，从而指导MFC检测B-ALL MRD时抗体的使用。
选择2014年6月至2016年1月在天津金域医学检验所血液病诊断中心应用MFC检测MRD阳性的B-ALL患者106例；B祖细胞正常对照组为50例急性早幼粒细胞白血病完全缓解后利用MFC检测MRD并且骨髓标本能检测到B祖细胞的患者。本研究符合2013年修订的《赫尔辛基宣言》要求，所有患者均知情同意。
采用美国Beckman Counter公司NAVIOS型流式细胞仪；MRD检测抗体组合见表1；相关单克隆抗体购自美国BD公司及Beckman Counter公司，溶血素（OptiLyse C）购自美国Beckman Counter公司。
急性B淋巴细胞白血病微小残留病多参数流式细胞术检测抗体组合
急性B淋巴细胞白血病微小残留病多参数流式细胞术检测抗体组合
| 编号 | 荧光素 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| FITC | PE | ECD | PE⁃Cy5 | PE⁃Cy7 | |
| 1 | CD58 | CD10 | CD34 | CD19 | CD45 |
| 2 | CD38 | CD13+CD33 | CD34 | CD19 | CD45 |
（1）加样：每个空FMC检测管加入相应的荧光素标记的抗体（表1），根据说明书加入相对应的量，取洗过2遍乙二胺四乙酸（EDTA）-K2/肝素抗凝的骨髓样本100 μl，振荡混匀，室温避光反应15 min；（2）溶解红细胞：每管加入溶血素200 μl，振荡混匀，室温避光反应5 min，溶解红细胞；（3）695×g离心5 min，弃上清液，振荡混匀，加入磷酸盐缓冲液（PBS），振荡混匀后离心，弃上清液，振荡混匀，加入固定液，振荡混匀过滤，上流式细胞仪检测。
应用NAVIOS流式细胞仪自带MXP软件获取数据，检测前常规使用标准荧光微球校准仪器。每管收获5×105个细胞，使用FCS-express 3.0软件分析原始数据。
在FSC/SSC、CD45/SSC及CD45/CD19设门，找到原始/幼稚B淋巴细胞，再分别用CD19/CD34、CD19/CD58、CD19/CD10、CD19/（CD13+CD33）、CD19/CD38设门，分析以原始/幼稚B淋巴细胞为残留的肿瘤细胞或者正常增生的B祖细胞。
细胞膜表面抗原表达阳性率≥20%为阳性，阳性率<20%为阴性；阳性患者中，超过正常表达水平为强阳性，低于正常表达水平为弱阳性。
正常对照组50例患者B祖细胞标志CD45呈弱阳性表达，未见CD58强阳性表达，未见CD13/CD33表达，同时正常强度表达CD10、CD19、CD34、CD38、CD45（图1），符合正常B细胞发育阶段抗原表达规律。
注：红色为幼稚细胞；绿色为有核红细胞；蓝色为成熟淋巴细胞；粉色为单核细胞；青色为粒细胞
106例B-ALL MRD阳性患者中，38例经过融合基因定量证实为阳性，18例骨髓涂片证实复发。所有患者CD19均阳性；27例（25.4%）CD34阴性或者弱阳性表达；23例（21.7%）CD10阴性或者弱阳性表达，24例（22.6%）CD10呈强阳性表达，共计47例（44.3%）有CD10的表达减低或增强（与正常B祖细胞表达的CD10强度进行对比）；98例（92.5%）CD58呈强阳性表达；64例（60.4%）CD13/CD33阳性或弱阳性表达；33例（31.1%）CD38阴性或弱阳性表达；21例（19.8%）CD45阴性。15例（14.1%）6种LAIP同时阳性，30例（28.3%）5种LAIP同时阳性，42例（39.6%）4种LAIP同时阳性，13例（12.3%）3种LAIP同时阳性，5例（4.7%）2种LAIP同时阳性，1例（0.9%）只有1种LAIP阳性（图2）。
注：红色为幼稚细胞；绿色为有核红细胞；蓝色为成熟淋巴细胞；粉色为单核细胞；青色为粒细胞
对比我中心37例B-ALL患者的初诊免疫表型和此次残留阳性的表型，结果发现：28例（75.7%）患者残留的肿瘤细胞的免疫表型和初诊表型一致，2例（5.4%）患者表现为CD19表达较初诊减弱，5例（13.5%）患者CD10表达较初诊减弱，2例（5.4%）患者表现为CD45表达较初诊减弱。
白血病性原始/幼稚B淋巴细胞有异质性，和正常B祖细胞的免疫表型有差异，这种差异即LAIP。本研究利用LAIP来识别正常B祖细胞和白血病细胞[6]。由于B细胞发育成熟过程发生在骨髓，所以正常的B祖细胞势必会对判断ALL MRD产生干扰，这是B-ALL MRD判断的难点。正常B细胞发育成熟过程分为如下4期[7]，Ⅰ期：早期B细胞，表达CD34、TDT、CD38，CD10强表达，CD20阴性，CD19和CD45表达较弱；Ⅱ期：前B细胞，CD34、TDT转阴，CD10表达减弱，CD20开始表达，胞质IgM阳性，CD19和CD45表达增强；Ⅲ期：过渡期B细胞，CD20、CD45表达增强，CD10弱阳性，膜上IgM阳性；Ⅳ期：成熟B细胞，CD10阴性，CD19、CD20、CD45呈高水平表达。也有文献报道把B细胞成熟过程分为早期、中间期和晚期[8]。早期B细胞表达CD34、TDT、CD19、CD10（强阳性）、CD38、CD22，而CD45弱阳性；中间期B细胞CD34、TDT阴性，CD10表达减弱，CD20表达，CD22和CD45表达增强；晚期成熟B细胞强表达CD45和CD22，CD38表达减弱或缺失，CD10阴性。目前文献报道的LAIP主要指的是抗原的异常表达[9]，主要表现如下，（1）跨系表达：如急性髓系白血病（AML）患者表达CD19（B细胞标志），B-ALL患者表达CD13（髓系标志）；（2）跨期表达：在正常细胞发育过程中，按成熟时间先后出现的抗原在肿瘤细胞中同时出现，如B-ALL患者CD34和CD20同时出现；（3）表达量的异常：包括抗原的表达增强及表达减低或者表达缺失，B-ALL患者CD58过表达，CD38表达减低或者缺失。
由于克隆选择及抗原漂移会导致一些白血病在复发时发生免疫表型改变，这势必会导致LAIP的变化，同时影响流式细胞术检测MRD的准确性。我们对37例B-ALL患者初诊和此次检测MRD阳性结果进行对比，发现有24.3%的患者出现抗原表达改变，表现为CD19、CD10和CD45的表达强度变化，但是结合其他抗体组合，识别出肿瘤细胞并不困难。所以MFC及更多抗原的加入可以最大限度地降低免疫表型改变对判断的影响。
不同实验室习惯于使用不同的抗体组合来检测B-ALL MRD。Theunissen等[10]使用CD66c/CD123及CD73/CD304组合，其中45% B-ALL患者有CD66c/CD123强阳性表达，而46% B-ALL患者CD73/CD304过表达；Baraka等[11]使用CD97，在92.8%的B-ALL患者中出现了CD97的表达。Veltroni等[12]使用CD9和CD22来检测MRD，虽然它们在正常B祖细胞也会表达，但在肿瘤细胞往往表达减弱；还有一些实验室采用CD27、CD44、CD200、CD86、CD49f、CD164等抗原来检测B-ALL MRD，由于相关文献较少，没有被广泛接受，但是在遇到疑难或者模棱两可的情况下，以上抗体不失为一个选择。
我们设计的抗原组合CD10、CD19、CD38、CD58、CD13、CD33可以覆盖B-ALL MRD常见LAIP的情况。其中最多见的情况是肿瘤细胞CD58强阳性表达，占92.5%；其次是肿瘤细胞跨系表达CD13或者CD33，占60.4%；而肿瘤细胞CD10表达异常占44.3%；CD38表达异常占33.1%。所以我们推荐B-ALL MRD的检测要包含这些抗体。除此以外，根据文献报道，CD9、CD22、CD66c、CD73、CD97、CD123也是比较好的LAIP，在选择抗体组合的时候，这些也可以考虑在内。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
