Effects of storage time of bone marrow specimens on the detection results of plasma cells immunophenotyping by flow cytometry

Wang Xianfeng; Zhou Huixing; Zhang Zhiyao; Chen Wenming

doi:10.3760/cma.j.issn.1009-9921.2019.08.004

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骨髓标本放置时间对流式细胞术浆细胞免疫表型检测结果的影响

白血病·淋巴瘤, 2019,28(8) : 468-472. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9921.2019.08.004

摘要

目的

探讨骨髓标本放置不同时间对流式细胞术检测正常浆细胞（nPC）和克隆性浆细胞（cPC）中不同抗原表达的影响。

方法

选择北京朝阳医院2017年9月至2018年1月初治的12例多发性骨髓瘤（MM）患者的骨髓标本为MM组，微小残留病（MRD）水平10^-3~10^-2；选择同期12例非浆细胞疾病患者的骨髓标本作为对照组。应用乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K₂）抗凝，2~8 ℃保存，分别在0、24、48和72 h标记荧光抗体组合CD56、CD138、CD45、CD38、CD117、CD81以及cκ、cλ、CD45、CD38、CD19、CD27。采用Diva软件分析以上10种抗原在nPC和cPC中表达的平均荧光强度（MFI），分析对照组nPC和MM组cPC占有核细胞的比例和绝对计数。

结果

与0 h相比，对照组骨髓标本放置24 h时，nPC中各抗原表达的MFI差异均无统计学意义（均P>0.05）。放置48 h时，nPC中抗原CD38、CD138、CD27、cκ和cλ表达的MFI减低，与0 h比较差异均有统计学意义（28 943±6 591比23 569±7 587，P=0.018；1 412±399比817±223，P=0.014；12 855±3 734比9 210±3 660，P=0.005；26 712±9 025比17 247±5 078，P=0.026；17 707±8 633比8 307±3 158，P=0.049）；CD45表达的MFI升高，与0 h比较差异有统计学意义（7 694±2 525比9 184±1 332，P=0.037）。放置72 h时，cκ和cλ表达的MFI高于0 h，但差异均无统计学意义（均P>0.05）。与0 h相比，MM组骨髓标本放置24 h时，cPC中各抗原表达的MFI差异均无统计学意义（均P>0.05）；放置48 h时，cPC中抗原CD38、CD138、CD81、cκ和cλ表达的MFI减低，与0 h比较差异均有统计学意义（16 664±11 744比10 130±10 026，P=0.003；2 041±1 145比1 371±696，P=0.047；2 679±784比1 524±1 153，P=0.025；29 102±18 138比18 372±10 327，P=0.038；16 314±12 728比9 752±6 271，P=0.034）；放置72 h时，cκ和cλ表达的MFI高于0 h，但差异均无统计学意义（均P>0.05）。随着放置时间的延长，nPC和cPC的绝对计数逐渐减低，放置24 h与0 h相比，差异均有统计学意义（均P<0.05），放置不同时间nPC和cPC比例分别比较差异均无统计学意义（均P>0.05）。

结论

骨髓标本放置不同时间对nPC和cPC中不同抗原表达的MFI和二者的绝对计数有影响，应在48 h内完成检测。

引用本文: 王显凤, 周慧星, 张之尧, 等. 骨髓标本放置时间对流式细胞术浆细胞免疫表型检测结果的影响 [J] . 白血病·淋巴瘤,2019,28 (8): 468-472. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9921.2019.08.004

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流式细胞术（FCM）可通过检测浆细胞膜抗原及胞质轻链来判断浆细胞的克隆性，从而被用于浆细胞肿瘤患者的诊断^[1,2]。目前关于骨髓标本放置时间对血液病免疫分型检测结果的影响报道较少，对于多发性骨髓瘤（MM）微小残留病（MRD）检测时骨髓标本放置时间对浆细胞免疫表型影响的研究鲜有报道。本研究将骨髓标本放置0、24、48和72 h后分别标记荧光抗体，分析正常浆细胞（nPC）和克隆性浆细胞（cPC）各抗原表达的平均荧光强度（MFI）、nPC和cPC比例及绝对计数，进一步探讨标本放置时间对FCM浆细胞免疫表型检测结果的影响。

1　资料与方法

1.1　临床资料

选择我院2017年9月至2018年1月收治的12例初治MM患者，诱导治疗后达完全缓解，且MRD水平10^-3~10^-2，其中男性8例，女性4例，中位年龄55岁（48~62岁），疗效评估采用国际骨髓瘤工作组（IMWG）的标准^[3]。以同期12例非浆细胞疾病（血小板减少或贫血）患者作为对照组，其中男性7例，女性5例，中位年龄58岁（47~69岁）。本研究符合《赫尔辛基宣言》的要求，并获得所有患者的知情同意。

1.2　方法

1.2.1　试剂与仪器

美国BD公司CantoⅡ型流式细胞仪，美国Spherotech公司荧光标准微球8-Peak（货号：RCP-30-5A）用于检查仪器光路。选择抗CD38、CD138、CD19、CD56、CD27、CD81、CD117、CD45、cκ、cλ共10种抗体进行检测。其中CD138-PE、CD56-FITC、CD81-APC-H7、CD117-APC为美国BD公司产品，CD45-Percp、cκ-FITC、cλ-PE为丹麦Dako公司产品，CD38-PE-cy7、CD19-APC、CD27-APC-cy7为美国BioLegend公司产品。溶血素、破膜剂和绝对计数管、Diva分析软件为美国BD公司产品。

1.2.2　标本制备

采集对照组及MM组骨髓标本5~8 ml，乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K₂）抗凝，进行FCM检测。骨髓标本2~8 ℃保存，检测前先计数白细胞总数，根据细胞计数，使反应体系中白细胞总数不超过5×10⁶个，分别于抽取骨髓后0、24、48和72 h用CD56、CD138、CD45、CD38、CD117、CD81，以及cκ、cλ、CD45、CD38、CD19、CD27组合标记样本并设置空白对照。

1.2.3　FCM检测

用荧光标准微球8-Peak校准流式细胞仪的光路和流路，以CD38/CD138或CD45/CD38设门，检测浆细胞中各抗原的表达，每份样本均检测并分析10⁶个细胞，记录对照组nPC和MM组cPC中各抗原表达的MFI、细胞比例和绝对计数。

1.3　统计学方法

应用GraphPad Prism 7.0和SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料符合正态分布者用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用Dunnett t检验；不符合正态分布者以中位数（范围）表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验，两组间比较采用Mann-Whitney U检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　骨髓标本放置不同时间对对照组nPC和MM组cPC中抗原表达的MFI的影响

对照组骨髓标本放置24 h，nPC中各抗原表达的MFI与0 h相比差异均无统计学意义（均P>0.05）。放置48 h时，CD38、CD138和CD27表达的MFI随着时间的延长而逐渐减低，与0 h相比，差异均有统计学意义（P=0.018，P=0.014，P=0.005）。放置72 h时，CD38和CD138表达的MFI与0 h相比，差异均有统计学意义（P=0.000 3，P=0.000 4）。放置48 h时，cκ和cλ表达的MFI低于0 h（P=0.026，P=0.049）；放置72 h时，cκ和cλ表达的MFI与0 h相比差异均无统计学意义（均P>0.05）。CD45表达的MFI随时间的延长逐渐增高，放置48 h时，与0 h相比差异有统计学意义（P=0.037）。CD117、CD56、CD19和CD81表达的MFI随着时间的延长无明显变化（均P>0.05）（表1）。表明放置时间影响nPC中抗原表达的MFI，最好在48 h内完成检测。

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表1

12例非浆细胞疾病患者不同骨髓标本放置时间正常浆细胞中各抗原表达的平均荧光强度（MFI）比较（±s）

表1

12例非浆细胞疾病患者不同骨髓标本放置时间正常浆细胞中各抗原表达的平均荧光强度（MFI）比较（±s）

放置时间（h）	样本数	CD38	CD138	CD27	CD56	CD19
0	12	28 943±6 591	1 412±399	12 855±3 734	387±229	6 938±1 585
24	12	27 817±8 596	1 284±375	11 700±3 524	446±327	5 522±1 261
48	12	23 569±7 587^a	817±223^a	9 210±3 660^a	456±362	5 479±2 152
72	12	22 992±7 490^a	840±250^a	9 461±2 488	483±211	4 426±1 661
F值		16.760	19.770	8.133	0.476	3.734
P值		0.001	0.000 2	0.009	0.600	0.600

放置时间（h）	样本数	cκ	cλ	CD81	CD117	CD45
0	12	26 712±9 025	17 707±8 633	4 936±1 622	141±50	7 694±2 525
24	12	21 639±8 499	11 943±7 185	4 682±2 553	159±59	5 750±1 269
48	12	17 247±5 078^a	8 307±3 158^a	3 608±2 106	144±42	9 184±1 332^a
72	12	28 527±8 627	18 134±8 351	4 134±2 250	148±47	9 588±859^a
F值		9.326	8.896	2.858	0.955	11.040
P值		0.002	0.005	0.117	0.379	0.007

注：与0 h相比，^aP<0.05

MM组骨髓标本放置24 h时，cPC中各抗原表达的MFI与0 h相比，差异均无统计学意义（均P>0.05）。放置48 h时，CD38、CD138、CD81、cκ和cλ表达的MFI随着时间的延长而逐渐减低，与0 h相比，差异均有统计学意义（P=0.003，P=0.047，P=0.025，P=0.038，P=0.034）。放置72 h时，CD81、cκ和cλ表达的MFI高于0 h，但差异均无统计学意义（均P>0.05）。CD27、CD117、CD56、CD19和CD45表达的MFI随着时间的延长无明显变化（均P>0.05）（表2）。表明放置时间影响cPC中抗原表达的MFI，最好在48 h内完成检测。

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表2

12例多发性骨髓瘤患者不同骨髓标本放置时间克隆性浆细胞中各抗原表达的平均荧光强度（MFI）比较（±s）

表2

12例多发性骨髓瘤患者不同骨髓标本放置时间克隆性浆细胞中各抗原表达的平均荧光强度（MFI）比较（±s）

放置时间（h）	样本数	CD38	CD138	CD27	CD56	CD19
0	12	16 664±11 744	2 041±1 145	4 301±1 251	5 078±3 452	642±353
24	12	15 132±10 636	1 823±1 166	3 810±1 556	5 221±2 411	212±159
48	12	10 130±10 026^a	1 371±696^a	2 824±1 203	4 819±2 981	246±152
72	12	13 619±8 595	1 425±790	2 863±1 563	5 618±4 283	183±160
F值		5.695	4.668	2.882	0.475	1.061
P值		0.017	0.034	0.112	0.620	0.362

放置时间（h）	样本数	cκ	cλ	CD81	CD117	CD45
0	12	29 102±18 138	16 314±12 728	2 679±784	3 299±2 764	3 496±2 261
24	12	21 398±12 315	12 339±9 147	2 324±937	3 204±2 759	2 831±2 390
48	12	18 372±10 327^a	9 752±6 271^a	1 524±1 153^a	3 018±2 343	2 452±1 685
72	12	31 184±10 947	17 770±6 149	2 706±1 316	2 761±2 407	2 960±1 736
F值		7.612	2.884	16.860	2.453	0.246
P值		0.006	0.034	<0.01	1.424	0.278

注：与0 h相比，^aP<0.05

2.2　骨髓标本放置不同时间对对照组nPC和MM组cPC比例和绝对计数的影响

对照组、MM组骨髓标本放置至24、48和72 h时，与0 h相比，cPC比例差异均无统计学意义（均P>0.05）；绝对计数随着时间的延长而逐渐减低，放置至24、48、72 h时，nPC、cPC与0 h相比差异均有统计学意义（均P<0.05）（表3），其中1例在72 h时cPC比例和绝对计数均为0。表明放置时间影响cPC的检测结果，导致MRD的假阴性。

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表3

骨髓标本放置时间对12例非浆细胞疾病患者正常浆细胞（nPC）和12例多发性骨髓瘤患者克隆性浆细胞（cPC）比例和绝对计数的影响[中位数（范围）]

表3

骨髓标本放置时间对12例非浆细胞疾病患者正常浆细胞（nPC）和12例多发性骨髓瘤患者克隆性浆细胞（cPC）比例和绝对计数的影响[中位数（范围）]

放置时间（h）	nPC比例（%）	nPC绝对计数（个/μl）	cPC比例（%）	cPC绝对计数（个/μl）
0	0.549（0.150~1.040）	530（93~3 889）	0.680（0.120~2.330）	568（28~2 845）
24	0.637（0.170~1.110）	479（75~3 260）^a	0.683（0.119~2.401）	472（26~2 645）^a
48	0.643（0.230~1.138）	356（58~2 501）^a	0.690（0.050~2.500）	390（16~2 445）^a
72	0.707（0.270~1.310）	242（36~2 002）^a	0.687（0~2.670）	277（0~2 200）^a
H值	0.537	8.541	5.404	8.107
P值	0.911	0.036	0.144	0.044

注：与0 h相比，^aP<0.05

3　讨论

采用FCM进行MM MRD的检测已是临床判断血液病疗效和评估预后的重要标准之一^[1,4,5,6]。但由于受设备条件、地理因素等的限制，采集送检与样本制备不能紧密衔接，标本放置时间过长会影响检测结果的准确性。

本研究结果显示，对照组nPC和MM组cPC在放置24 h时抗原表达的MFI与0 h相比，差异无统计学意义（P>0.05），放置时间≥48 h时，部分抗原表达的MFI与0 h相比，差异有统计学意义（P<0.05）。证实对照组nPC膜抗原CD38、CD138、CD27、CD45和胞质抗原cκ、cλ在采集后48 h内检测是可靠的，抗原CD19、CD117、CD81和CD56在采集后72 h内检测是可靠的。文献[7]报道nPC仅少数表达CD56，通常不表达CD117，因此放置时间对CD56和CD117影响较小。MM组cPC抗原CD38、CD81、CD138和胞质抗原cκ、cλ在采集后48 h内检测是可靠的，CD45、CD19、CD117和CD56在采集后72 h内检测是可靠的。nPC和cPC的胞质cκ在放置48 h后MFI逐渐增高，72 h的MFI高于0 h，但差异无统计学意义（P>0.05），cλ在72 h表达的MFI高于48 h（P<0.05），与0 h相比差异无统计学意义（P>0.05）。进一步分析发现，随着放置时间的延长，细胞活性逐渐减低，死细胞增多，可与许多抗体非特异性结合干扰免疫表型的判断，从而影响MFI，此外样本pH值的变化会影响抗原表达^[8]。文献[9]报道骨髓样本常温放置时，16 h内膜抗原检测不受影响，48 h内胞质抗原检测不受影响，超过时效时抗原表达的MFI会逐渐减低，本研究结果与文献报道相似。临床和实验室标准指南推荐骨髓标本常温放置需在24 h内完成检测，冷藏保存能延长标本时效，但并未提供具体的保存时效^[8]。放置时间会影响抗原的检测，如重要的浆细胞设门抗原CD45、CD38和CD138，及判断浆细胞克隆性最特异的指标cκ和cλ，因此骨髓浆细胞要获得理想染色，建议冷藏放置48 h内完成检测。

本研究结果还显示，随着骨髓标本放置时间的延长，nPC和cPC比例仅有轻微增高的趋势，与0 h相比差异无统计学意义（P>0.05），可能是放置期间粒细胞退化所致；放置24 h时，nPC和cPC的绝对计数与0 h相比差异有统计学意义（P<0.05），随着时间的延长，绝对计数逐渐减低。其中1例MM患者骨髓标本在放置72 h时检测MRD转阴，提示放置时间影响细胞外环境，再加上化疗后细胞变得更脆弱，导致肿瘤细胞容易被破坏，出现假阴性结果^[8]。文献[10]报道53例MM MRD的cPC比例在24~48 h有轻微增加或保持恒定，48 h绝对计数较0 h减少，本研究结果与文献报道一致。提示浆细胞的绝对计数需在采集后24 h内完成，对于低比例残留检测时效非常关键。

本研究应用2管6色抗体组合共10个抗体验证了骨髓标本冷藏放置0、24、48和72 h后nPC和cPC中各抗原表达的MFI，证实采集后48 h内检测nPC和cPC中抗原表达的MFI不受影响，浆细胞绝对计数需在采集后24 h内检测。本研究不足之处是未在采集后0~24 h增加浆细胞绝对计数检测时间点，以进一步确定浆细胞绝对计数检测最佳时效，其次是本研究未纳入MRD<10^-3的样本进行研究，而且样本量较小，后续会进一步分析和探讨。

利益冲突

利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突

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贡献者信息

王显凤

首都医科大学附属北京朝阳医院血液科　100020

周慧星

首都医科大学附属北京朝阳医院血液科　100020

张之尧

首都医科大学附属北京朝阳医院血液科　100020

陈文明

首都医科大学附属北京朝阳医院血液科　100020

通信作者

陈文明

首都医科大学附属北京朝阳医院血液科　100020

Email：13910107759@163.com

关键词

骨髓; 浆细胞免疫表型; 流式细胞术; 放置时间;

利益冲突

利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突

历史

出版日期：2019-08-25

收稿日期：2019-01-22

本文编辑

周薇

本文责任校对

郎华

Original Article

Effects of storage time of bone marrow specimens on the detection results of plasma cells immunophenotyping by flow cytometry

Wang Xianfeng, Zhou Huixing, Zhang Zhiyao, Chen Wenming

Published 2019-08-25

Cite as J Leuk Lymphoma, 2019,28(8): 468-472. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9921.2019.08.004

Abstract

Objective

To explore the effects of different storage time of bone marrow specimens on the expressions of different antigens in normal plasma cells (nPC) and clone plasma cells (cPC) by flow cytometry.

Methods

The bone marrow samples of 12 patients with multiple myeloma (MM) who were treated in Beijing Chaoyang Hospital from September 2017 to January 2018 were selected as MM group. The minimum residual disease (MRD) level in MM group was 10^-3-10^-2. The bone marrow samples of 12 patients without plasma cell diseases were used as control group. Bone marrow samples were anticoagulated with ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium (EDTA-K₂) and stored at 2-8 °C. The fluorescent antibodies CD56, CD138, CD45, CD38, CD117, CD81 and cκ, cλ, CD45, CD38, CD19, CD27 were labeled at 0, 24, 48 and 72 h, respectively. The average fluorescence intensity (MFI) of the above 10 antigens expressed in nPC and cPC was analyzed by Diva software. The proportion and absolute count of nPC in control group and cPC in MM group were analyzed.

Results

In control group, when stored for 24 h, compared with 0 h, the difference of MFI of antigens in nPC was not statistically significant (P > 0.05). When stored for 48 h, compared with 0 h, the MFI of CD38, CD138, CD27, cκ and cλ in nPC decreased, and the differences were statistically significant (28 943±6 591 vs. 23 569±7 587, P= 0.018; 1 412±399 vs. 817±223, P = 0.014; 12 855±3 734 vs. 9 210±3 660, P = 0.005; 26 712±9 025 vs. 17 247±5 078, P = 0.026; 17 707±8 633 vs. 8 307±3 158, P = 0.049); the MFI of CD45 increased, and the difference was statistically significant (7 694± 2 525 vs. 9 184±1 332, P = 0.037). When stored for 72 h, compared with 0 h, the MFI of cκ and cλ increased, but the differences were not statistically significant (both P > 0.05). In MM group, when stored for 24 h, compared with 0 h, the difference in MFI of antigens in cPC was not statistically significant (P > 0.05). When stored for 48 h, compared with 0 h, the MFI of CD38, CD138, CD81, cκ and cλ decreased, and the differences were statistically significant (16 664±11 744 vs. 10 130±10 026, P = 0.003; 2 041±1 145 vs. 1 371±696, P = 0.047; 2 679±784 vs. 1 524±1 153, P = 0.025; 29 102±18 138 vs. 18 372±10 327, P = 0.038; 16 314±12 728 vs. 9 752±6 271, P = 0.034). When stored for 72 h, compared with 0 h, the MFI of cκ and cλ increased, but the differences were not statistically significant (both P > 0.05). The absolute count of nPC and cPC gradually decreased with the prolongation of the storage time, and the difference was statistically significant (both P < 0.05) when stored for 0 h and 24 h. There was no significant difference in the percentage of nPC and cPC among different storage time (all P > 0.05).

Conclusion

Different storage time of bone marrow samples has effects on the MFI of antigens and absolute count of nPC and cPC, and the detection should be completed within 48 h.

Key words:

Bone marrow; Plasma cell immunophenotyping; Flow cytometry; Storage time

Contributor Information

Wang Xianfeng

Department of Hematology, Beijing Chaoyang Hospital Capital Medical University, Beijing 100020, China

Zhou Huixing

Zhang Zhiyao

Chen Wenming

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