分析2010——2016年唐山市甲型H1N1流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA ）基因序列进化特征。
选取唐山市3家哨点医院流感样病例分离到的24株甲型H1N1病毒，通过RT-PCR和测序方法获得HA基因的全长序列，运用分子生物学软件和统计学软件对序列进行拼接、比对和分析。
同源进化分析显示，24株甲型H1N1流感病毒HA基因与疫苗株A/California/7/2009的核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.0%~99.0％和97.0%~98.5%。进化分析显示，2010- 2016年唐山地区流行的甲型H1N1流感病毒属于1、7、6三个基因分支，其中6分支毒株分为6C、6B、6B.1和6B.2亚支。氨基酸位点分析显示，不同毒株与疫苗株比较存在8~16处氨基酸位点改变，其中7个变异涉及3个抗原表位：H138Q/Y和S203T突变位于Ca区，N125S、K153E、S162N、K163T/Q突变位于Sa区，S185T突变位于Sb区同时也位于受体结合部位；2015—2016流行季6B.1分支毒株抗原位点S162N突变增加了新的潜在糖基化位点。
与疫苗株比较，随着时间推移唐山地区甲型H1N1流感病毒发生了抗原漂变，未来仍应关注6B分支流行株的变化。
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对唐山市人民医院、唐山妇幼保健院和遵化市人民医院3家流感哨点医院流感样病例的咽拭子标本采用Real-time RT-PCR法检测病毒核酸，阳性标本接种犬肾细胞（MDCK），参照《全国流感监测方案》中的操作步骤进行病毒分离与鉴定。2010年10月—2016年3月流感季共分离到457株流感病毒，按照不同年份和不同医院（唐山市人民医院和唐山妇幼保健院毒株均命名路南株，遵化市人民医院毒株命名遵化株），随机选取甲型H1N1流感病毒株24株，进行核酸提取、扩增和测序，所有毒株均经国家流感中心复核确认。
提取流感病毒RNA，采用QIAGEN公司（德国）的One-Step RT-PCR kit进行反转录聚合酶链反应（RT-PCR），反应体系50 µL：5xPCR buffer 10 µL、10 mM dNTP Mixe 2 µL、RT-PCR Enzyme Mix 2 µL、RNase Inhibitor 0.2 µL、上下游引物各1 µL、RNase Free Water 23.8 µL、模板10 µL；扩增条件：50℃ 30 min，95℃ 15 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环；72℃ 10 min。反应体系50 µL：5xPCR buffer 10 µL、10 mM dNTP Mixe 2 µL、RT-PCR Enzyme Mix 2 µL、RNase Inhibitor 0.2 µL、上下游引物各1 µL、RNase Free Water 23.8 µL、模板10 µL；扩增条件：50℃ 30 min，95℃ 15 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 10 min；扩增引物参照文献[6]，凝胶电泳检测，阳性PCR产物委托生工生物工程股份有限公司进行双向测序。
采用DNA STAR 7.1和BioEdit v7.2.5软件对序列进行拼接和比对，保留1701 bp的ORF区域，去除1~51位核苷酸编码信号肽，对HA基因核苷酸和氨基酸序列进行同源性分析；利用NCBI的Basic Local Aligment Search Tool （BLADT）下载与国内外相似核苷酸序列，采用MEGA 6.06软件Neighbor Joining方法绘制核苷酸种系发生树，Bootstrap法（replication=1000）进行检验，以A/California/07/2009 （KC781785）为参照株结合文献[7,8]进行HA基因分型，利用NetNGlyc 1.0 Server （http://www.cbs. dtu.dk/services/NetNGlyc/ ）分析糖基化位点。
