观察小体积肝切除对肝硬化大鼠模型肝脏再生及肝功能恢复的影响。
采用CCl4腹腔注射方法制备肝硬化大鼠模型，肝硬化大鼠模型实施20%肝切除(n＝30)，以肝硬化假手术组(n＝30)和正常大鼠20%肝切除组(n＝30)作对照。在肝硬化模型制备至20%肝切除术后3个月的过程中，采用苏木精-伊红染色观察肝脏形态结构的变化，定期检测模型肝功能、凝血功能，采用Western blot、Real-time PCR检测肝细胞生长因子和转化生长因子-β以及增殖细胞核抗原在肝细胞中的表达情况，并与对照组进行比较。
在肝硬化模型制备过程中，苏木精-伊红染色提示大鼠肝脏逐渐呈现肝纤维化、肝硬化样改变；与正常大鼠比较，肝硬化动物模型中转化生长因子-β基因、蛋白表达逐渐增强。在接受20%肝切除术后3个月，肝硬化模型肝功能及凝血功能均较术前有所改善，同时TGF-β表达水平显著低于作为对照的肝硬化假手术组(P<0.05)，而肝细胞生长因子和增殖细胞核抗原基因、蛋白表达水平显著高于作为对照的肝硬化假手术组(P<0.05)。
小体积肝切除有助于促进肝硬化大鼠模型肝脏再生及肝功能的恢复，这为进一步深入开展小体积肝切除防治肝硬化进展的相关研究提供了新思路。
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各种病因导致的肝硬化是威胁人类健康的一种常见疾病。随着肝硬化程度的不断加重，患者可出现肝功能异常、脾功能亢进、腹水、上消化道出血、肝性脑病甚至肝脏恶变等并发症。所以，采取有效的治疗方法防治肝硬化的进程，对避免以上并发症的发生具有重要的意义。研究表明[1,2]，肝硬化的发生、发展与肝细胞再生密切相关，因此调控肝细胞再生是防治肝硬化的一个重要途径。本项目旨在观察小体积肝切除对肝硬化大鼠模型肝脏再生相关因子表达、以及肝功能恢复的影响，从而评估采用小体积肝切除防治肝硬化进展的可行性和有效性。
Sprague-Dawley(SD)大鼠90只，雄性，重180～220 g/只，购于中山大学动物实验中心，并于中山大学动物实验中心饲养；CCl4，分析纯，浓度99.5%，购于广州市亨达化工公司。
90只SD大鼠随机分为3组：肝硬化＋20%肝切除组、肝硬化假手术组、正常大鼠＋20%肝切除组，每组30只动物。
肝硬化模型建立方法：(1)诱导期：实验动物在诱导前以每升蒸馏水中含0.35 g苯巴比妥钠的溶液作为大鼠的唯一饮用水，时间为1周；饲料使用普通大鼠饲料。(2)成模期：按0.5 ml/100 g剂量予以腹腔注射40%CCl4中性菜籽油溶液，每周2次，持续4周；同时以10%乙醇溶液为其唯一饮用水。第5周开始改为用50%CCl4中性菜籽油溶液，以0.5 ml/100 g剂量腹腔注射，每周2次，持续4周；同时改为以30%乙醇溶液为其唯一饮用水。上述建模时间共计9周。
肝左外叶切除(约占总肝体积20%)，首先按每公斤体重0.35 ml予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，以10%碘伏溶液和75%酒精溶液消毒皮肤，取中上腹部剑突下直切口切开腹壁，显露肝脏，并以丝线绕过肝左外与其他肝叶的分界处，确切结扎，然后于结扎线左侧切除肝左外叶，确切止血后关腹，术后常规饲养。假手术组仅行麻醉后开腹、关腹操作。
分别于20%肝切除或假手术前、术后7 d、术后1个月3个时间点进行肝功能和凝血功能、血常规检测；分别在肝硬化造模前，肝硬化1个月、3个月，手术后1个月、3个月5个时间点断颈处死6只实验动物，并切除肝脏组织标本，切片后进行常规苏木精-伊红染色，观察肝脏病理改变情况；以Western blot和实时荧光定量PCR(qPCR)检测肝转化生长因子-β(Transforming growth factor, TGF-β)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF)和增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的蛋白和基因表达情况。
以RIPA组织裂解液提取肝脏组织总蛋白，取20 μg总蛋白上样于SDS-PAGE凝胶并电泳，然后转移到PVDF膜，分别与TGF-β、HGF、PCNA抗体和GAPDH抗体4 ℃孵育过夜，与酶标记的二抗(1∶3 000)室温孵育2 h，然后将化学发光物滴加于PVDF膜上，以Image Pro Plus系统扫描分析，以TGF-β、HGF、PCNA/GAPDH扩增条带灰度比值表示3种蛋白相对表达水平。
采用HP Total RNA Kit提取切除肝脏组织总RNA，以Oligo(dT)primer为引物，采用First-Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一链，以此链作为模板，采用2×All inOne qPCRMix进行扩增，具体步骤参照说明书进行。PCR的反应体系为：95 ℃，预变性10 min，95 ℃，30 s；52 ℃，45 s；72 ℃，45 s，40个循环，以自动PCR仪进行检测。采用2-△△Ct相对定量法计算上述3种mRNA的相对表达水平。引物序列见表1。
肝再生调节因子的引物序列
肝再生调节因子的引物序列
| 引物名称 | 上游引物 | 下游引物 |
|---|---|---|
| TGF-β | TACAGGGCTTTCGCTTCAGT | CCACCACCCTGTTGCTGTAG |
| HGF | AAGATTGGATCAGGACCTTGTGAG | AATACCAGGACGATTTGGGATGG |
| PCNA | AGCCACTCCACTGTCTCCTACAC | AGAACACGCTGGCATCTCAGA |
| GAPDH | CTCCCATTCCTCCACCTTG | CCACCACCCTGTTGCTGTAG |
采用SPSS 15.0软件进行统计学分析。计量资料数据采用(
±s)表示，组间数据比较采用LSD-t检验、t检验或Wilcoxon秩和检验。P<0.05认为差异有统计学意义。
肝硬化造模前正常肝脏肉眼观色泽红润，苏木精-伊红染色肝小叶结构清楚，无结节样改变，无明显脂肪样变及纤维化(见封三，图1A、E)；肝硬化造模1个月肝脏色泽灰暗，出现结节样改变，苏木精-伊红染色肝小叶结构部分不清，出现纤维组织分隔，肝细胞出现脂肪样变性，肝窦淤血、扩张(见封三，图1B、F)；肝硬化造模3个月肝脏呈明显硬化结节样改变，苏木精-伊红染色肝小叶结构不清，纤维组织分隔成大小不等的肝细胞团，肝细胞排列紊乱，大量肝细胞呈脂肪样变性，肝窦明显淤血、扩张(见封三，图1C、G)；20%肝切除术后3个月肝脏小叶结构基本清，纤维组织分隔不明显，肝窦扩张较轻伴轻度淤血，部分肝细胞脂肪变性，细胞核部分增大，双核增多，提示肝细胞增殖能力增强(见封三，图1D、H)。
注：正常肝脏(Ⓐ、Ⓔ)；肝硬化造模1个月(Ⓑ、Ⓕ)；肝硬化造模3个月(Ⓒ、Ⓖ)；20%肝切除术后3个月(Ⓓ、H)(Ⓔ～Ⓗ：苏木精－伊红染色，×200)。
分别在20%肝切除或假手术(仅开腹)术前、术后7 d、术后1个月3个时间点进行肝硬化模型和正常动物的肝功能、凝血功能和血小板检测(见封三，图2)。结果显示：肝硬化大鼠在接受20%肝切除术后1个月，其肝功能指标AST、ALT、TBIL、PT均比术前显著降低(P<0.05)，虽然上述指标改善程度不如同样接受20%肝切除的正常大鼠显著，但其降低水平显著优于肝硬化假手术组(P<0.05)。肝硬化大鼠在接受20%肝切除术后1个月，白蛋白水平虽然有所升高，但与术前及假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)；肝硬化大鼠在接受20%肝切除术后1个月，血小板(PLT)较术前显著升高(P<0.05)，且其升高水平显著优于肝硬化假手术组(P<0.05)。
注：与术前比较，*P<0.05；与肝硬化假手术组比较，**P<0.05。
分别在肝硬化造模前(正常动物)，肝硬化1个月、3个月，手术后1个月、3个月5个时间点，采用Western blot技术进行肝脏再生相关因子蛋白表达的检测(图3)。结果显示：肝硬化造模过程中TGF-β蛋白逐渐升高，但在肝硬化大鼠20%肝切除术后1、3个月的TGF-β蛋白表达，较术前肝硬化3个月时显著降低(P<0.05)；肝硬化造模过程中HGF蛋白逐渐降低，但在肝硬化大鼠20%肝切除术后1、3个月的HGF蛋白表达，较术前肝硬化3个月时显著升高(P<0.05)；肝硬化造模过程中PCNA蛋白表达逐渐降低，但在肝硬化大鼠20%肝切除术后1、3个月的PCNA蛋白表达，较术前肝硬化3个月时显著升高(P<0.05, P<0.05)。
注：B、C：与肝硬化3个月时比较，*P<0.05；与肝切除术后1个月时比较，**P<0.05；D：与肝硬化1个月时比较，*P<0.05；与肝硬化3个月时比较，**P<0.05。
分别在肝硬化造模前(正常动物)，肝硬化1个月、3个月，手术后1个月、3个月5个时间点，采用Real-time PCR技术进行肝脏再生相关因子基因表达的检测(见封三，图4)。结果显示：与正常大鼠比较，在肝硬化造模前1个月过程中TGF-β基因表达逐渐增强，其后至造模3个月期间稍有降低；接受20%肝切除模型的肝脏TGF-β基因表达显著低于肝硬化3个月时的表达水平(P<0.05)，而且也显著低于作为同期对照的肝硬化假手术组模型肝脏内TGF-β基因表达水平(P<0.05)；与正常大鼠比较，在肝硬化造模过程中HGF基因表达变化趋势不明显；但是在接受20%肝切除的肝硬化模型中，虽然HGF升高水平显著低于接受20%肝切除的正常动物，但其肝脏HGF基因表达显著高于肝硬化3个月时的表达水平(P<0.05)，而且也显著高于作为同期对照的肝硬化假手术组模型肝脏内HGF基因表达水平(P<0.05)。与正常大鼠比较，在肝硬化造模过程中PCNA变化趋势不显著；但在接受20%肝切除的模型中，其肝脏PCNA蛋白表达显著高于肝硬化3个月时的表达水平(P<0.05)，而且也显著高于作为同期对照的肝硬化假手术组模型肝脏内PCNA蛋白表达水平(P<0.05)。
注：与肝硬化3个月时比较，*P<0.05，与肝硬化假手术组比较，**P<0.05。
正常肝脏具有很强的再生能力。人体在接受70%无硬化肝脏切除术后，剩余肝脏不仅能维持正常肝脏功能，而且术后4～6个月剩余肝脏可再生至与原肝脏体积类似大小[3]。动物实验研究表明[4,5,6]，肝硬化大鼠接受大体积(70%)肝切除术后1～2个月，剩余肝脏即可再生至术前肝脏体积，且肝脏功能较术前好转。但是，小体积肝切除是否具有促进肝脏再生的作用？目前尚未明确。因此，笔者探讨了小体积(20%)肝切除对肝硬化大鼠模型肝脏再生及肝功能的影响。
在肝硬化肝脏功能变化方面，已知肝硬化可导致肝功能异常、甚至肝功能失代偿。本研究结果显示，肝硬化大鼠在接受20%肝切除术后1个月，其肝功能指标(AST、ALT、TIBL)、凝血酶原时间(PT)均比术前显著好转。虽然肝硬化大鼠接受20%肝切除术后，上述肝功能及凝血功能指标改善程度不如同样接受20%肝切除的正常大鼠显著，但是其改善程度仍显著优于未接受肝切除的肝硬化大鼠。上述结果提示，小体积肝切除(20%)有利于改善动物模型的肝脏功能。
相关研究表明[7,8]，多种肝再生调节因子在肝再生过程中发挥着重要的调节作用。TGF-β是一种具有多种生物学功能的蛋白多肽，其广泛存在于正常组织、细胞中并发挥着复杂的生理作用，包括促进成纤维细胞生长、调节细胞周期、细胞凋亡和免疫调节等诸多方面的作用。近年来研究表明[9,10]，TGF-β在肝纤维化和肝硬化的发生、发展过程中具有重要的负性调节作用，其可对肝实质细胞、肝窦内皮细胞、以及与纤维化相关的多种生长因子进行调节，同时也通过调节基质代谢的多种蛋白酶，从而发挥致纤维化和肝硬化的作用。正常肝组织内一般在较低水平表达TGF-β。相关研究显示[10]，在肝硬化肝部分切除后早期(24 h)，残肝组织中TGF-β的表达与切除的肝硬化肝组织中表达无明显差异，但是在肝硬化肝切除后72 h，TGF-β在残存肝组织的肝细胞中的表达显著增强，这提示肝再生早期TGF-β的作用并不明显。由于上述研究仅观察了肝硬化肝切除术后短时间内(72 h)的变化水平，而肝切除术后肝再生往往持续数月时间。所以，笔者对肝硬化动物模型20%肝切除前、后3个月时间内TGF-β的表达变化进行了较长期的检测。结果表明，在肝硬化造模过程中，肝再生负性调节因子TGF-β蛋白表达逐渐增强，这提示肝再生一定程度受到抑制，并促使肝硬化发生、发展。但是，在肝硬化模型接受20%肝切除术后，TGF-β基因、蛋白表达减弱，这有利于肝硬化模型接受20%肝切除术后的肝脏细胞再生。
HGF是一种具有多种生理功能的细胞因子，主要由肝星状细胞产生。研究表明[11,12]，HGF具有启动肝再生的生理功能，并在肝细胞增殖过程中起着重要的作用。在已知可促进肝细胞增殖的细胞因子中，目前已证实HGF的作用最为显著。肝再生大鼠模型动物实验显示[12]，正常大鼠在接受部分肝脏切除术后，肝脏组织和血液中的HGF表达都显著增强。另有研究显示[13]，在纤维化的肝组织中HGF也有显著表达，这可能是纤维化的肝脏自我恢复的机制之一。本研究结果显示，在接受20%肝切除的大鼠肝硬化模型中，肝脏HGF基因和蛋白表达均显著高于术前肝硬化3个月时的水平，而且也高于作为同期对照的肝硬化假手术组模型肝脏内HGF蛋白表达水平。这提示，20%肝切除可显著促进肝硬化肝脏合成HGF，从而有利于肝脏再生。同时，肝硬化20%肝切除术后HGF升高水平显著低于正常肝脏20%肝切除术后的HGF水平，这提示肝硬化肝脏的术后再生能力及再生速度，均弱于接受肝部分切除术的正常肝脏。
PCNA于1978年在系统性红斑狼疮患者的血液中首次被发现并命名，因其仅存在于正常增殖的细胞及肿瘤细胞内而得名。近年来研究发现[14]，PCNA与细胞DNA合成有着密切的关系，在细胞增殖过程中具有重要的促进作用，是反映细胞增殖状态的理想指标。有研究表明[15]，PCNA在肝切除后肝细胞DNA复制高峰期表达量显著增加，并参与了促进肝细胞再生的过程。本研究结果显示，与正常大鼠比较，在肝硬化造模过程中PCNA变化趋势不显著。但是，在接受20%肝切除的模型中，其肝脏PCNA表达显著高于肝硬化3个月时的表达水平，而且也显著高于作为同期对照的肝硬化假手术组模型肝脏内PCNA表达水平，这提示20%肝切除可显著促进肝硬化肝脏合成PCNA，从而有利于促进肝脏再生。
综上所述，本研究结果表明，小体积肝切除具有促进肝硬化大鼠模型肝脏功能恢复，并可引起肝再生正性调节因子表达增强，负性调节因子表达减弱，从而发挥促进肝硬化肝脏在一定程度内再生的作用。本研究为实施小体积肝切除促进肝再生的相关研究提供了新的科学依据。
