间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作为一类来源广泛的低免疫原性多能干细胞已被用于多种危重症疾病及免疫性疾病的细胞治疗研究。大量临床研究显示，MSCs尽管在受损组织中的定植率低，但可以通过旁分泌因子来调节机体免疫、抑制炎症反应、修复受损上皮。儿童急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是严重器官功能障碍时发生最早的并发症，目前尚无有效的药物治疗，病死率高。研究显示MSCs可以有效减轻肺水肿、改善肺功能，降低病死率，对于其作用机制的了解有利于推动MSCs从实验阶段转化为临床应用。本文将重点对MSCs修复ALI的相关机制进行综述。
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肺保护性通气治疗和液体支持等对症治疗改善了急性肺损伤(acute lung injury，ALI)的预后，总病死率已由20世纪90年代的60%降至近10年的30%以下。不同于成人的是，儿童ALI机械通气管理方案尚无大规模临床研究报告，主要基于既往经验或推论成人数据，通气后呼吸机相关肺损伤可能会影响小儿肺部发育，一些小样本研究报告显示，机械通气后患儿出现各种呼吸异常，后遗症率达33%～100%[1]。而ALI/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)时即已出现严重的肺内分流和(或)死腔以及肺顺应性显著下降，常规机械通气难以奏效，病死率仍居高不下，故亟需寻求一种新的创新性方法提高生存率。动物实验数据表明间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植可以减少内毒素性的ALI[2]。目前MSCs已被用于一些临床试验研究，在美国已有120个临床试验登记在案，涉及心血管、肺、肾和自身免疫性疾病等。近几年，MSCs细胞疗法已成为治疗ALI的研究热点。
MSCs虽然不具有胚胎干细胞的全能可塑性，但其取材方便，易于分离和繁殖，体外可以向三个胚层诱导分化且不存在医学伦理学问题等优点，逐渐受研究人员所重视。目前能够从多种人类组织中分离出MSCs，包括骨髓、胎盘、脂肪和脐血、羊膜、牙髓、真皮等。不同组织来源的MSCs生物学特性及旁分泌因子表型也有所不同。Hsiao等[3]和Ikegame等[4]比较不同来源的MSCs发现，骨髓间充质干细胞(BMSCs)更容易分化为骨和软骨组织，而脂肪来源的间充质细胞(ASCs)更容易分化为脂肪组织，mRNA表达分析显示ASCs比其他组织来源的MSCs分泌胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)-D、IL-8浓度更高，说明ASCs可能具有更好的血管生成能力。这可能是由于组织细胞生存的特异性微环境不同导致基因调控分化信号不同所致。
从免疫学角度看，MSC具有低免疫原性，低表达MHCⅠ和MHCⅡ，同时普遍缺乏T细胞共刺激分子，如CD80、CD86等，限制了抗原呈递和共刺激能力，增加植入组织的免疫耐受。迄今为止，用于人类移植的MSCs临床前实验还未出现免疫不良反应[5]。Hare等[6]将MSCs输入急性心肌梗死患者体内观察6个月后，中期研究试验结果未发现任何不良反应，同时检测患者胸片和肺功能，也未发现致瘤性病变和肺纤维化改变。Battiwalla和Hematti[7]应用BMSCs进行成人或儿童的异基因造血干细胞移植，亦无严重的输液反应及延迟毒性反应。在肺损伤远期疗效的动物模型研究方面，气管内移植MSCs对新生鼠高氧肺损伤具有长期修复效果，且无长期不良反应[8]。尽管如此，MSCs在人体内的有效性和安全性还需进一步研究。
2008年Schinköthe等[9]首次大规模的调查统计了人MSCs分泌可溶性因子的种类，将其按功能分为：免疫抑制、抗凋亡、促增殖、调控血管生成4类。MSCs分泌的生长因子如血管内皮生长因子、角质细胞生长因子(KGF)和肝细胞生长因子(HGF)具有细胞保护和修复作用。血管生成素-2(Ang-2)分子可以改善内皮细胞的屏障功能，促进血管修复。此外，MSCs还可以通过释放抗炎/促炎症细胞因子、脂质介质如前列腺素E2等调节树突细胞、T细胞、B细胞和中性粒细胞的功能和应答，抑制混合淋巴细胞反应和有丝分裂原的淋巴增殖，抑制免疫反应。这些肺保护性可溶性因子及其作用机制的识别有可能使之成为最具临床应用前景的多能干细胞，为开辟药物性治疗肺损伤提供新途径。
ALI致病因素多样，发病机制复杂，共同的作用通路可能是炎症反应失调控导致肺血管内皮和肺泡上皮细胞损伤。炎症细胞及其释放的炎症介质、细胞因子构成了ALI炎症反应和免疫调节的"细胞网络"和"细胞因子网络"，在ALI疾病发生、发展过程中发挥重要作用。MSCs不仅具有多能分化和自我增殖更新的能力，还可以分泌一系列生长因子、细胞因子、趋化因子及各种免疫调节因子，调控炎症反应，减少炎症介质，修复受损上皮和内皮细胞，减轻肺水肿，促进肺功能的恢复[10]。
MSCs具有分化为多种非造血组织的实质细胞形态和表型的能力，可以增加成纤维样细胞的数量，分化为支气管上皮细胞和Ⅰ型肺泡上皮细胞(ATⅠ)、ATⅡ。迁移是解释干细胞修复组织损伤的假说之一，组织损伤的程度和类型不同，干细胞募集程度也不同[11]。Liu等[12]发现当Wnt3α或LiC1加入到联合培养系统中活化wnt/β-连环蛋白信号通路时，ATⅡ上皮细胞特异性标记物表面蛋白C(SPC)、SPB和SPD相应增加，wnt通道中的GSK3β和β-连环素在分化过程中表达上调。加入通道抑制剂DKK1时，这些因子的表达不同程度地受到抑制，这说明MSCs向ALI肺损伤部位迁移分化为ATⅡ的潜在机制可能涉及wnt/β-连环素信号通路的活化。然而，干细胞募集到肺、干细胞定植程度、损伤效果的信号性质如何仍不清楚。
2006年国际细胞组织协会虽然定义了MSCs的最低标准，但至今仍缺乏对MSCs分离方法和特征化描述，而且没有有效的方法测量体内MSCs的生物活性[13]。不同研究组之间对于MSCs定植分化的报道各有不同。过去，我们常在免疫荧光显微镜下观测到供体细胞标记物共区域化。然而，越来越多的学者发现这种技术对分析MSCs肺部定植并不可靠。由于罕见自发荧光细胞的干扰，可能会误以为MSCs在肺部定植。因此组织学和流式细胞学计数、分子生物学联合分析可能更为准确地反映MSCs在肺部的定植情况[14]。Gupta等[15]气管内输入MSCs内毒素诱导的ALI鼠体内2 d后，发现小鼠支气管肺泡灌洗液和血浆中的炎性因子巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-2和肿瘤坏死因子(TNF)-7浓度明显下降，抗炎因子IL-10水平升高，但是检测MSCs肺组织定植率不足5%，MSCs的作用机制更可能是由于MSCs归巢到受损组织床，释放旁分泌可溶性因子来调节免疫反应，同时通过释放生长因子和抗炎因子来调节内皮细胞通透性，减轻炎症，修复组织。在实验性上皮细胞液体运输模型中，肺泡灌洗液中含有高水平促炎症因子如IL-1β、IL-8、TNF-α、TGF-β和MIP等，输入MSCs后发现TNF-α和IL-1β、MIP-1α等炎症因子水平显著降低，抗炎因子IL-10、IL-1受体抗体(IL-1ra)水平显著增加，MSCs还可以分泌一些保护因子，如KGF、Ang-1、HGF等，促进肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞修复，提高生存率。Lee等[16]发现KGF通过部分上调上皮细胞Na＋通道(ENaC)基因表达和增加Na＋-K＋-ATP酶活性，恢复ATⅡ的阿米洛利敏感钠离子通道摄取分数，增加肺水跨肺泡上皮转运，进一步使用siRNA技术敲除KGF基因，80%的MSCs对肺水清除的保护性作用消失，说明KGF是改善肺泡液体清除率，减轻肺水肿的一个重要因素。之后LaFcmina等[17]通过测量跨上皮电阻和细胞间的通透性证明，KGF显著增加培养基中肺泡上皮屏障功能是通过调节肌动蛋白的骨架来增强细胞间的紧密连接，而并不改变ATⅠ或ATⅡ细胞连接蛋白的表达。Ang-1也可以促进顶端旁F-肌动蛋白的形成，阻止上皮细胞通透性的增加[18]。HGF是MSC分泌的另一种特殊上皮生长因子，同样具有调节细胞通透性的作用。Birukova等[19]发现HGF可以通过Tiaml活化Rac基因，抑制RhoGTP酶的活性来缩短细胞间的距离，阻止肌动蛋白应力纤维的形成，稳定肺微血管内皮细胞，减轻肺血管内皮细胞通透性。在ALI和肺纤维化鼠模型中，MSC转染Ang-1和KGF比起单独输入MSCs更能改善肺泡炎症和通透性[20,21]，这似乎也从侧面证明了MSCs分泌的细胞因子或蛋白产物具有修复肺损伤的功能。
炎症反应失调控是ALI的主要核心事件致病因子或炎症细胞及其相关介质导致肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞损伤，引起肺微血管通透性增高，肺泡渗出液增多。正常情况下，经典模式M1型巨噬细胞活化杀伤病原微生物，激活Ⅰ型免疫反应促进炎症反应的发生，但是产生的细胞因子亦会损伤肺组织。MSCs可以减少肺部中性粒细胞释放，同时可以诱导肺泡产生修复型M2型巨噬细胞。Ionescu等[22]用LPS诱导制备大鼠ALI模型，气管内注入MSCs和成纤维细胞，对比发现MSCs可以释放IGF-1促进Ym1和Arg-1表达，减少iNOS活性，从而改变巨噬细胞表型，产生具有损伤修复/抗炎作用的M2型巨噬细胞，激活Ⅱ型免疫反应，生成高水平抗炎因子和低水平促炎因子，调节免疫，促进组织修复和血管生成。然而，Mei等[23]在体外共培养实验中，没有发现MSCs对巨噬细胞的吞噬活性有任何的作用，MSCs能否改变巨噬细胞的表型仍存有疑问。
IL-10主要是由单核细胞/巨噬细胞分泌的细胞因子，可以抑制中性粒细胞的黏附和跨膜转移，下调Th1细胞因子，促使T细胞由Th1向Th2转变，最终使炎症反应转为抗炎反应。研究表明在鼠型脓毒症中MSCs可以释放前列腺素E2，通过前列腺素EP2和EP4受体促进肺单核巨噬细胞分泌IL-10，同时抑制淋巴细胞、树突细胞活化，减少TNF-α和巨噬细胞炎性蛋白-2(MIP-2)等促炎因子分泌，调整促炎及抗炎的平衡，改善脓毒症小鼠器官功能，降低病死率，而用IL-l0抗体或IL-10受体抗体预处理MSCs后，这种保护性作用消失[24]。
IL-1和TNF-α是介导ALI/ARDS最主要的炎性因子。IL-1ra抑制巨噬细胞释放TNF-α及阻止IL-1α依赖性的T细胞增殖而发挥抗炎作用[25]。Ortiz等[26]发现MSCs通过分泌IL-1ra与IL-β炎症因子竞争性结合IL-1受体，降低博来霉素致肺损伤肺胶原沉积、肺纤维化。除此之外，MSCs可以抑制自然杀伤(NK)细胞对靶细胞的溶解作用。MSCs不仅能强烈抑制IL-2诱导的NK细胞增殖，还能降低NK细胞的细胞毒性及分泌活性，其机制可能和NK细胞表面活性受体(如NKp30、NKp44、NKG2D)的表达下调有关[27]。MSCs可以通过细胞间的相互作用，产生细胞因子抑制T细胞和B细胞、NK细胞的增殖及其免疫反应，发挥免疫调节的功能。总之，MSCs不仅通过调节细胞可塑性发挥作用，也通过旁分泌功能显著干扰肺疾病的病理生理进程。
MSCs最早被认为具有临床价值是由于其低免疫原性，移植后发生排斥反应风险低，过去用来治疗严重免疫过度活化状态，如同种异基因骨髓移植后，移植物抗宿主病或脓毒症。在ALI中，MSCs免疫抑制功能是否会影响自身宿主抗感染的能力？Gupta等[28]在体内和体外做了一系列实验来观察MSCs在Ecoli肺炎鼠型模型中的效果和机制，发现气管内输入MSCs可以增加免疫细胞的吞噬能力，减少早期炎症反应，减轻肺损伤的严重度，提高存活率。尽管MSCs有抗免疫的作用，但是抗菌清除的作用增加。抗菌效果很大程度是由于脂质运载蛋白2上调，减少细菌含铁细胞铁复合物，而减少细菌铁的供应，参与天然免疫抑菌作用[28]。同一研究组还发现一种人类抗菌肽hCAP-18/LL-37也参与MSCs抗菌作用[29]。2011年Lee等[30]发现KGF可能也具有抗微生物作用，随后在体外研究发现，单核细胞可表达KGF受体，KGF可以通过AKT磷酸化减少单核细胞的凋亡，从而增强对细菌的清除，而这种抗菌能力很大程度是来自于MSCs分泌脂质运载蛋白，而不是MSCs细胞培养基修饰肺泡巨噬细胞的能力。目前还不确定抗菌效果对患鼠有多大的改善能力，尤其在治疗ALI/ARDS时，MSCs对宿主抗细菌感染功能的影响有多大，这些都是未来的研究方向。
以往认为MSC主要是通过炎症因子诱导迁移至受损伤的部位并分化为特定的组织细胞保护组织功能，随着MSCs机制研究的不断深入，越来越多的实验证明MSCs主要通过外分泌体/微泡或整个细胞器转移细胞-细胞间的信号调节免疫，抑制炎症反应来达到治疗作用。目前大多关注到MSCs的可溶性因子如生长因子、抗炎因子和最近发现的抗菌肽，可以改变内皮细胞的通透性、调节炎症反应失调，减轻肺水肿。利用MSCs产生的蛋白和细胞因子产物治疗肺损伤可能比细胞治疗更有效。然而鼠型或许多啮齿动物来源的MSCs在许多方面与人类MSCs不同，如免疫异质性和基因的稳定性，不是所有的MSCs在培养中都保留了其"干细胞特性"，培养条件对MSC的生长和表型有重要作用但是仍然不能完全清楚[31]。MSCs的治疗效果(如何定义MSCs)和MSCs的免疫性相对于免疫调节作用如何需要进一步研究。不管怎么样，对于阐明MSCs作用机制的研究仍需继续，以期将来出现治疗ALI/ARDS完整而安全的新方案。
