运用变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC)技术检测肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae，MP)基因型，了解儿童MP流行状况。
对我院300例患儿鼻咽吸出物进行表型确证试验，采用PCR对标准菌株和MP表型阳性的临床菌株进行PCR扩增，扩增产物经DHPLC分析，通过与标准菌株色谱峰比对进行临床菌株基因分型。
300例患儿咽拭子经过24 h培养后呈阳性110例。用特异引物扩增MP-129、MP-FH标准株和标本，分别得到2 280 bp和2 580 bp基因片段。110株临床菌株经DHPLC分析检测出107株是P1-Ⅰ型，均是1b亚型，3株是P1-Ⅱ型，均是2a亚型。
运用DHPLC技术检测出本院儿童发生MP感染以P1-Ⅰ、1b亚型为主。
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肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae，MP)介于细胞与病毒之间，属于原核细胞型生物，是引起儿童气管炎、支气管炎、原发性不典型肺炎的重要病原体，也是引起成年人社区获得性肺炎的常见病原之一[1,2]。MP感染具有流行性，通常3～7年有一次流行高峰，人类感染MP后，一般具有2～10年免疫力[3]。MP主要通过对呼吸道黏膜上皮细胞黏附和定植感染宿主，其黏附过程由MP特殊顶端结构黏附细胞器完成，其中P1蛋白被认为是肺炎支原体主要黏附素。早年基于P1基因重复序列不同研究，将MP分为Ⅰ、Ⅱ两个基因型[4]。近年来关于MP-P1基因变异屡有报道[5]，临床MP肺炎发病率不断升高，并且时常出现难治性肺炎支原体肺炎的相关报道，其是否与MP亚型改变有关，目前尚缺乏明确定论，虽然国外已有关于MP亚型及P1基因变异的报道，但国内尚无相关报道。本研究采集MP感染儿童鼻咽吸出物，运用变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC)技术对MP基因进行分型研究，以期了解MP亚型流行状况，为MP肺炎患儿诊治提供理论依据。
收集2011年2月至2013年2月我院儿科300例因呼吸道感染住院患儿的鼻咽吸出物标本，男180例，女120例，年龄28 d～12岁，病程2 d～2个月。上呼吸道感染54例，支气管肺炎120例，毛细支气管炎36例，大叶性肺炎22例，间质性肺炎28例，支气管哮喘40例。所有研究均获得患儿家长知情同意，并通过苍南县人民医院伦理委员会批准。
MPⅠ型标准菌株MP-129(ATCC29342)和Ⅱ型标准菌株MP-FH(ATCC15531)购自美国疾病控制与预防中心。Taq酶(Promage公司，美国)；PCR Kit(TaKaRa公司，日本)；DNA提取Kit(TaKaRa公司，日本)；WAVE4500变性高效液相色谱仪(Transgenomic公司，美国)；MJ100PCR扩增仪(Mercheas公司，美国)；Hers50低温高速离心机(Hers公司，德国)；BRD450凝胶成像系统(BERDER公司，美国)。
MP培养及鉴定按照产品操作步骤说明进行。用基因组DNA纯化试剂盒(genomic DNA purification kit，Promega)按说明提取标准菌株及培养阳性菌株基因组DNA，紫外定量后冻存于－20 ℃备用。
参照文献[4]设计1组和2组两对单链寡核苷酸作为MP P1基因不同区域引物(表1)，并委托上海生工生物工程公司合成引物。PCR反应体系50 μl，包含10 mmol Tris/HCl，50 mmol KCl，2 mmol MgCl2，0.2 mmoldNTPs，引物各为8 pmol，Taq酶1 U及5 μl DNA模板。PCR扩增条件：预变性95 ℃ 2 min；变性95 ℃ 1 min，复性56 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，共30个循环；最后延伸72 ℃ 10 min。产物用2%琼脂糖凝胶(0.5 μg/ml溴化乙淀)电泳，3 000 bp DNA Marker为参照标准，用凝胶成像系统观察结果。
PCR引物序列
PCR引物序列
| 分组 | 引物序列上游 | 引物序列下游 | 片段大小(bp) |
|---|---|---|---|
| 1组 | 5′-CTGCCTTGTCCAAGTCCACT-3′ | 5′-AACCTTGTCGGGAAGAGCTG-3′ | 2 280 |
| 2组 | 5′-CGAGTTTGCTGCTAACGAGT-3′ | 5′-CTTGACTGATACCTGTGCGG-3′ | 2 580 |
确定四组MP参照菌株，每组选一种标准菌株为参照菌株。根据PCR扩增分组结果，将标准菌株及临床菌株PCR产物分别与相应参照菌株PCR产物混合，取10 μl按1∶1比例混合，经95 ℃加热5 min后，以1 ℃/min速度降温至25 ℃。取10 μl混合物自动进样到DHPLC片段分析系统中，以1.5 ml/min的速度进样，以特定浓度缓冲液B冲洗3.3 min后，在260 nm处检测标准菌株和临床菌株色谱峰图。
比较标准菌株色谱峰图，根据峰形、峰数及停留时间等方面的相同和不同之处，得到待测临床菌株的基因型。另外，通过观察峰高和形状变化判断相同基因型的不同临床菌株与标准菌株之间色谱峰匹配度，验证DHPLC分析MP P1基因产物重复性。DHPLC的乙腈浓度梯度由缓冲液A(0.1 mol三乙胺醋酸盐)和缓冲液B(0.1 mol三乙胺醋酸盐，25%乙腈)混合而成。
300例患儿咽拭子经过24 h培养后呈阳性110例。其中男68例，女42例，年龄1～7岁，平均年龄(5.6±2.5)岁。其中肺炎或重症肺炎89例，上呼吸道感染13例，间质性肺炎2例，支气管哮喘6例。
对所有培养后培养基进行常规PCR MP基因检测，所有培养结果阴性培养基，其MP基因PCR检测均呈阴性；110例阳性标本中，仅有21例标本MP基因PCR检测阳性，其阴性符合率100%，阳性符合率为21.0%，PCR产物为2 280 bp和2 580 bp基因片段。
选取标准菌株MP-129和MP-FH分别为MP P1-Ⅰ组和MP P1-Ⅱ组的参照菌株，2株标准菌株和110株临床菌株与相应组别的参照菌株混合，经DHPLC分析建立了3种不同基因型别的标准菌株色谱峰图，即MP P1-Ⅱ2a、MP-FH、MP P1-Ⅰ1b(图1A、图1B)，其中MP P1-Ⅱ2a和MP-FH标准菌株色谱峰型一致(图1A)；110株临床菌株色谱峰与标准菌株色谱峰比对显示：3株MP P1-Ⅱ组为单一洗脱峰，峰形态与MP-FH(MP P1-Ⅱ2a)标准色谱峰型一致(图1A)；107株MP P1-Ⅰ为双峰与MP129(MP P1-Ⅰ1b)标准色谱峰型一致(图1B)；没有发现不同于2种标准菌株色谱峰以外其他异常洗脱峰。MP感染以MP P1-Ⅰ、1b亚型为主。
A. DHPLC 65 ℃分析MP的2株标准菌株(MP P1-Ⅱ2a、MP-FH)及4株临床菌株(P30、C8、P21、Q38)结果；B. DHPLC 67 ℃分析MP的2株标准菌株(MP P1-Ⅱ2a、MP P1-Ⅰ1b)及4株临床菌株(E32、P31、P17、Q10)结果。
DHPLC分析同种基因型如MP P1-Ⅰ1b的不同临床菌株，所得色谱峰的峰高和峰形状变化与标准菌株色谱峰相符，色谱峰之间高度匹配，显示DHPLC分析MP基因的重复性好(图2)。
目前，用于诊断MP感染的方法很多，如直接在复杂的微生物介质中分离培养、在感染的急性期和恢复期分别进行血清学检查[6]、补体结合实验、代谢抑制实验、采用分子生物学方法从基因水平检测MP等[7,8,9]，各种检测MP方法准确性和特异性都比较高，但各种方法均有不同的优缺点，均不适合快速大规模筛查MP菌株基因型。近年来研究表明，DHPLC技术灵敏性和特异性均达到100%突变检测平台[10]，已在国内外实验室和研究中心得到广泛应用，该技术适用大面积筛查MP基因型及其亚型，它已用于MP流行病学监测。将当地主要流行MP标准菌株制成色谱峰图待测标本与其比对即可，该技术减少测序，具备快速和经济的优点。
近年来，DHPLC技术已被运用到各种细菌对不同抗生素耐药基因变异检测。运用DHPLC方法进行MP基因分型研究，建立了MP不同组群不同基因型别的标准色谱峰图库的理念，完全依靠DHPLC分析后比对标准色谱峰图筛查基因型，如发现不同于已建立的标准色谱峰图的样本，经测序证实为新基因型别后，又可利用DHPLC按照相同步骤进行分析，建立新的标准色谱峰图。
本研究运用DHPLC分析110株临床菌株MP基因型，其中107例临床标本与MP-129标准株色谱峰相符，即为MP P1-Ⅰ型；3例临床标本与MP-FH标准株色谱峰相符，即为MP P1-Ⅱ型。接着我们分别对2株标准株进行分析，发现所有MP P1-Ⅰ型临床标本均为1b亚型，MP P1-Ⅱ和MP-FH标准菌株色谱峰型一致，3例临床标本均为2a亚型。我们任意挑选MP P1-Ⅰ型和MP P1-Ⅱ临床标本进行测序，测序结果进一步证明了基因分型的准确性。本研究表明，在本地区发生的MP感染以MP P1-Ⅰ、1b亚型为主。据悉我国对MP临床标本进行DHPLC分析基因型属于首次报道，并可以为未来MP分子流行病学研究提供基础信息。
综上所述，本研究运用DHPLC对本地区MP感染者鼻咽吸出物标本进行了MP基因分型，发现本地区所发生的MP感染以P1-Ⅰ、1b亚型为主，但病情严重程度与基因型之间是否存在联系仍有待进一步研究。除此之外，对MP基因型进行纵向监测在MP流行病学研究中具有重要意义。
