探讨两个原发性肉碱缺乏症家系的临床特点及基因突变位点的检测，分析其中3例患儿的猝死原因。
回顾性分析两个原发性肉碱缺乏症家系的临床资料，分别对两个家系的先证者行血氨、血乳酸、肝酶、心肌酶测定，血酰基肉碱分析和尿有机酸分析，提示原发性肉碱缺乏症可能，进一步对两家系成员行SLC22A5基因测序分析。
两个家系先证者游离肉碱及多种酰基肉碱明显低下，死亡患儿在发病前均有发热、呕吐、嗜睡等表现。家系Ⅰ的先证者为c.760C>T(p.R254X)纯合突变，家庭其他成员均为c.760C>T杂合子。患儿死于严重心律失常及心肌病。尸体解剖病理提示部分心肌纤维断裂或呈波浪状排列、肝细胞弥漫性脂肪变性、部分肺泡腔可见中性粒细胞浸润。家系Ⅱ中2例死亡患儿疑似"病毒性心肌炎"。先证者并未发病，但已出现轻微心肌肥厚、血氨增高等，经左卡尼汀治疗后各项指标恢复正常，存在c.760C>T和c.844dupC(p.R282fs)两个杂合突变，分别遗传自父母。
原发性肉碱缺乏症患儿，在疾病的缓解期无特殊表现，发病急且病情迅速恶化，甚至死亡。家系Ⅰ先证者因全身肉碱缺乏而发生心源性猝死。c.760C>T纯合突变、c.760C>T和c.844dupC复合杂合突变可能分别是家系Ⅰ和家系Ⅱ发病的分子基础。早期诊断、规范治疗是决定远期预后的关键。
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原发性肉碱缺乏症(primary carnitine deficiency，PCD)属常染色体隐性遗传病，SLC22A5基因突变导致Na＋依赖性有机阳离子/肉碱转运体(OCTN2)缺陷，引起线粒体长链脂肪酸β氧化障碍，大量脂质在细胞内蓄积，继而出现一系列生化异常和脏器损害，如低酮性低血糖、心肌病、肝肿大、肌无力，甚至死亡[1]。在不同国家或地区发病率不一，日本约为1∶40 000，杂合子携带率1%；澳洲约为1∶120 000；法罗群岛发病率高达1∶300；我国上海新华医院新生儿筛查数据显示，患病率约为1∶45 000[2,3,4,5]。PCD是少数可以治疗的遗传代谢病之一，如果能在不可逆的器官损害出现之前进行早期诊断和规范治疗，患儿基本可以获得和正常人相同的生活质量[6]。本研究通过对两个有猝死病例的PCD的家系分析，特别是其中1例患儿进行了尸检病理分析，深入探讨PCD患儿的临床特征、猝死原因及基因突变位点。
家系Ⅰ：先证者，男，5个月，因"呕吐伴精神差半天"入院。患儿无明显诱因，半天内两次呕吐并迅速出现面色苍白、精神差，急诊以"呕吐查因，病毒性心肌炎？"收住院。查体：嗜睡，面色苍白。T 36.3 ℃，R 60次/min，P 125次/min，心率125次/min，心音低钝，心律齐，无杂音。肝脏右肋下6 cm，质硬，脾脐下2 cm，质硬。四肢肌力、肌张力正常对称。双侧巴氏征、柯氏征、布氏征阴性。头颅CT未见异常。入院前心肌酶示LDH 1709 U/L、CK 676 U/L、CK-MB 42.9 ng/L、AST 335 U/L、肌钙蛋白0.76 μg/L。入院后心肌酶示LDH 1 783 U/L、CK 865 U/L、CK-MB 61.70 ng/L、AST 354 U/L、肌钙蛋白3.47 μg/L；血氨126.1 μmol/L(参考值：9～30 μmol/L)；肝功能示ALB 38.6 g/L、ALT 118 IU/L。血气分析示pH 7.406，PO2 76 mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)，PCO2 29.7 mmHg，BE－6 mmol/L，HCO3－ 18.6 mmol/L，Na＋132 mmol/L，K＋4.4 mmol/L，血糖4.2 mmol/L。心脏彩超示左心增大，收缩功能正常低限；心电图示窦性心动过速。肝脏弥漫性增大。死亡前1 h突然出现室扑、室颤，从发病到死亡不到24 h。死亡后血液酰基肉碱回报游离肉碱0.918 μmol/L及多种酰基肉碱明显低下，尿有机酸分析己二酸、葵烯二酸、辛二酸增高，诊断为PCD。患儿姐姐、弟弟、父母酰基肉碱谱均正常。姐姐平时易疲劳，生长发育良好，家系系谱见图1。
A家系Ⅰ系谱图；B家系Ⅱ系谱图。
家系Ⅱ：先证者，男，11个月，因"两个姐姐分别在2岁2个月和3岁9个月不明原因猝死"就诊。查体：发育正常，营养良好，神志清。心肌酶、肝功能正常，血氨140.1 μmol/L。心脏彩超示左室壁稍肥厚，收缩功能正常低限。血液酰基肉碱示游离肉碱及多种酰基肉碱明显低下(表1)，尿有机酸未见明显异常，诊断为PCD。补充左卡尼汀100 mg/(kg·d)，7 d后血氨降至正常，游离肉碱上升至30.182 μmol/L。目前规范治疗中，生长发育正常，心脏彩超复查无异常，收缩功能正常。两个姐姐平素易疲劳，生长发育稍落后，起病均有发热、呕吐、精神差，起病12 h内均出现昏迷、抽搐，急诊时猝死，未来得及做相关检查，家长拒做尸检，死因未明，家系系谱见图1。
两个原发性肉碱缺乏症家系8例成员的游离肉碱及酰基肉碱水平(μmol/L)
两个原发性肉碱缺乏症家系8例成员的游离肉碱及酰基肉碱水平(μmol/L)
| C0 | C2 | C3 | C4 | C5 | C6 | C8 | C10 | C12 | C14 | C16 | C18 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 家系Ⅰ | ||||||||||||||
| 先证者 | 0.91 | 1.40 | 0.11 | 0.03 | 0.02 | 0.04 | 0.01 | 0.03 | 0.01 | 0.01 | 0.05 | 0.02 | ||
| 姐姐 | 11.63 | 6.99 | 1.02 | 0.12 | 0.07 | 0.02 | 0.08 | 0.08 | 0.03 | 0.03 | 0.44 | 0.24 | ||
| 弟弟 | 20.41 | 14.06 | 1.22 | 0.17 | 0.10 | 0.04 | 0.04 | 0.07 | 0.05 | 0.09 | 0.89 | 0.23 | ||
| 父亲 | 16.32 | 10.07 | 1.27 | 0.15 | 0.18 | 0.05 | 0.05 | 0.07 | 0.06 | 0.10 | 0.79 | 0.38 | ||
| 母亲 | 19.27 | 11.89 | 1.29 | 0.21 | 0.19 | 0.06 | 0.05 | 0.08 | 0.07 | 0.11 | 0.88 | 0.48 | ||
| 家系Ⅱ | ||||||||||||||
| 先证者 | ||||||||||||||
| 治疗前 | 1.03 | 1.89 | 0.04 | 0.05 | 0.01 | 0.01 | 0.02 | 0.01 | 0.02 | 0.01 | 0.05 | 0.03 | ||
| 治疗1周 | 19.43 | 6.36 | 0.61 | 0.07 | 0.05 | 0.02 | 0.03 | 0.03 | 0.02 | 0.08 | 0.32 | 0.20 | ||
| 父亲 | 14.90 | 5.76 | 0.60 | 0.10 | 0.02 | 0.06 | 0.15 | 0.13 | 0.07 | 0.04 | 0.38 | 0.20 | ||
| 母亲 | 18.84 | 7.10 | 0.98 | 0.16 | 0.06 | 0.04 | 0.09 | 0.11 | 0.02 | 0.06 | 0.76 | 0.35 | ||
| 参考值 | 10-60 | 6-30 | 0.5-4 | 0.06-0.5 | 0.04-0.3 | 0.01-0.15 | 0.01-0.3 | 0.02-0.5 | 0.02-0.2 | 0.02-0.25 | 0.3-2 | 0.2-1.2 | ||
注：家系Ⅱ先证者两个姐姐未检测。C0(游离肉碱)；C2(乙酰肉碱)；C3(丙酰肉碱)；C4(丁酰肉碱)；C5(异戊酰肉碱)；C6(己酰肉碱)；C8(辛酰肉碱)；C10(葵酰肉碱)；C12(月桂酰肉碱)；C14(肉豆蔻酰肉碱)；C16(棕榈酰肉碱)；C18(十八碳酰基肉碱)。
应用液相-串联质谱法，除家系Ⅱ两个死亡患儿未检测外，两个家系其他成员均采血分析酰基肉碱，结果患者可见游离肉碱及多种酰基肉碱明显低下，携带者肉碱谱在参考范围，但较正常人偏低，见表1。
抽取两个家系共8名成员(家系Ⅱ先证者两个姐姐未留取)EDTA抗凝静脉血1 ml，用于SLC22A5基因突变分析，所有检测送至华大基因及广州金域检验中心完成。家系Ⅰ检出c.760C>T(p.R254X)一种突变，家系Ⅱ发现c.760C>T和c.844dupC(p.R282fs)两种突变，见图2。本研究均征得患儿家长的同意，并经医院伦理委员会讨论通过。
家系Ⅱ测序图：(a)(b)(c)(d)，先证者(a)(b)，c.760C>T和c.844dupC复合杂合突变；父亲(c)，c.760C>T杂合突变；母亲(d)，c.844dupC杂合突变；家系Ⅰ测序图：(e)(f)(g)(h)(i)，先证者(e)，c.760C>T纯合突变；父亲(f)，c.760C>T杂合突变；母亲(g)，c.760C>T杂合突变；姐姐(h)，c.760C>T杂合突变；弟弟(i)，c.760C>T杂合突变。
肝脏弥漫性增大，肝细胞弥漫性脂肪变性，部分心肌纤维断裂或呈波浪状排列，未见炎症细胞浸润，部分肺泡腔可见中性粒细胞浸润。
肉碱是一种水溶性氨基酸类维生素。正常人体所需肉碱的75%来源于食物，主要是肉类和奶制品，其余为内源性的，在肝脏和肾脏合成。长链脂肪酸是心肌、骨骼肌等能量代谢旺盛组织供能的重要物质，但长链脂肪酸不能自由通过线粒体膜进入线粒体。肉碱的功能是将长链脂肪酸载入线粒体内进行β氧化。当细胞内肉碱缺乏时，长链脂肪酸难以进入线粒体内氧化分解，能量代谢障碍及酮体生成减少，糖异生减少，对机体造成损伤。
编码肉碱转运蛋白(OCTN2)的SLC22A5基因突变，是PCD的病因。肉碱通过位于细胞膜上的OCTN2进入细胞内，OCTN2在心肌、骨骼肌、小肠、肾小管、成纤维细胞和胎盘中高表达，对维持细胞内肉碱的高浓度起重要作用，其功能缺陷致使肠内肉碱吸收减少、尿中排泄增多、血浆及组织细胞内肉碱水平降低。SLC22A5基因位于5q31，由10个外显子组成，编码557个氨基酸。目前已发现90多种突变，其中外显子1为热点突变区域[7]。不同种族及人群中突变谱存在差异，R282X多见于高加索人群；R169W在意大利患者中多次被观察到；S467C和W132X在日本秋田地区人群中最常见；而我国人群R254X突变频发，其中我国台湾地区R254X约占总等位基因突变的50%，我国香港地区患者携带率达1∶125，上海新华医院的数据显示，在20例患儿中有8例检测出R254X突变[5,8]。因此有研究认为R254X为中国人群PCD的一个基础突变[9]。R254X为无义突变，导致肉碱转运蛋白编码提前终止而影响转运体功能。该突变位于肉碱转运蛋白的第5跨膜区环路(L5)，而跨膜区在肉碱的识别和转运中起关键作用[7]。R254X突变几乎测不到OCTN2转运活性，携带该突变的患者多以心肌病为主，纯合子几乎都表现为心肌病[5,8,9]。本研究两个家系均携带R254X，家系Ⅰ先证者为纯合子，表现为心肌病；家系Ⅱ先证者为杂合子，虽没发病但也有轻微的心肌肥厚。家系Ⅱ还发现另一个c.844dupC移码突变，翻译产物蛋白质自第282位氨基酸残基精氨酸起，编码发生紊乱。该突变预计会导致所编码的蛋白质发生截短从而丧失其正常功能。同时，突变c.844delC被HGMD数据库收录为致病突变。dbSNP数据库及HGMD数据库及近几年最新文献的检索确认c.844dupC为一新突变。2015年美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)联合分子病理学学会(AMP)发布的基因变异的解读标准及指导原则[10]：移码突变如在父母中得到证实，遗传方式符合常染色体隐性遗传特点，可认为该位点为可能致病突变。综合分析认为c.844dupC突变可能为致病突变。
PCD的病情进展缓慢而隐匿，平素基本无症状，或仅有生长发育稍迟缓，未能引起家长的注意，常常因为"感冒、腹泻"等诱因，急性起病，病情进展迅速，甚至猝死。猝死的原因多为急性能量代谢危象、心力衰竭及严重心律失常。家系Ⅰ先证者在5个月时无明显诱因发病，发病后病情迅速恶化，最终死于心肌病及严重心律失常。尸检病理示多器官功能衰竭，特别是心脏受损严重。家系Ⅱ先证者两个姐姐分别于2岁2个月和3岁9个月急性发病，疑似"病毒性心肌炎"，病情进展迅速，24 h内死亡，遗憾的是没能留取标本做代谢病筛查，未能进一步尸检和基因诊断，死因不明。两个家系的先证者均有心肌受损的表现：家系Ⅱ先证者，即使在没有发病的情况下仍然有心肌受损的表现，心脏彩超示左室壁稍肥厚，收缩功能正常低限，而心肌酶正常；家系Ⅰ先证者，发病时心脏彩超示左心增大，收缩功能正常低限，同时还表现出肌钙蛋白的明显升高，肌钙蛋白在24 h内由0.76 μg/L升高至3.47 μg /L，结合心肌酶升高，给临床医生"急性病毒性心肌炎"的印象。家系Ⅰ先证者的尸检报告示部分心肌纤维断裂或呈波浪状排列，未见炎症细胞浸润。所以心肌病是儿童PCD的重要临床表现之一，包括扩张型心肌病和肥厚型心肌病，是全身性肉碱缺乏的体现[11]。Tripp等[12]报道由PCD引起的扩张型心肌病类似于心内膜弹力纤维增生症，并且扩张型心肌病的发生率大于肥厚型心肌病，这种心肌病的平均发生年龄是2～4岁，出生时几乎无症状，慢慢出现心肌病的症状和心力衰竭[13]。肉碱的缺乏导致细胞能量不足，引起心肌收缩力降低，促进心肌重构，而脂肪酸的堆积加速了心肌不可逆的损伤过程，游离脂肪酸还可改变心肌细胞电生理活动导致心律失常[14]。这可以解释在患儿死亡前1 h突然出现室扑、室颤导致心源性休克而猝死。
两个家系的先证者均未发现低血糖发作。国外文献报道，一个家系中猝死的两个患儿中也同样没有低血糖发作[15]，但本文两个先证者血氨均有升高。家系Ⅱ的先证者，只是因为两个姐姐均为原因不明的猝死而来检查，发现血氨升高，继而血酰基肉碱分析诊断为PCD，可家长未发现患儿有任何不适。因此，除了尿素循环障碍等其他代谢性疾病外，血氨升高也是PCD的重要生化指标[9]。但在PCD的病情缓解期，血氨就有明显升高，还未有相关文献报道。PCD和其他的脂肪酸β氧化障碍性疾病可导致大量酰基辅酶A的蓄积，造成尿素循环的酶表达受到抑制，从而引起血氨升高，家系Ⅱ先证者早期尿素循环的酶受到抑制是否先于肝酶、心肌酶的升高，这一现象是否具有普遍性，这一现象是否与患儿的基因型有关，这些问题有待进一步研究。
PCD需与继发性肉碱缺乏症相鉴别，继发性肉碱缺乏症包括Fanconi综合征、有机酸血症、脂肪酸代谢障碍等。摄入不足、慢性丢失、长期素食、药物(丙戊酸、抗生素、激素)、慢性消耗性疾病等均可导致继发性肉碱缺乏。但根据国内外文献及我们的临床经验[6,16]，原发性与继发性肉碱缺乏症的游离肉碱下降的程度大不相同，PCD游离肉碱(C0)常常低于5 μmol/L。
PCD是少数可以治疗的代谢性疾病之一，如果能得到早期诊断，在不可逆的器官损害出现之前开始规范治疗，患儿可以获得和正常人几乎相同的生活质量。补充左旋肉碱，急性期100～500 mg/d，经静脉或口服，维持30～100 mg/d，口服。饮食治疗也很重要，争取食物来源的左旋肉碱(牛羊肉)，营养支持，补充维生素B2、B6、C及铁剂等，保证自身肉碱合成。感染会增加体内分解代谢，加重体内肉碱的消耗，即使在感染不明确的情况下，我们也建议积极控制感染，可以为临床治疗原发病争取时间。急性期肉碱的补充量是维持期的3～5倍。家系Ⅱ先证者经左旋肉碱治疗1周后，游离肉碱及酰基肉碱、血氨恢复正常，1个月后左室心肌及收缩功能均恢复正常水平，随访1年治疗效果好，没有不良反应。两个家系(家系Ⅱ除先证者两个姐姐未检测)其余成员均为杂合突变携带者，游离肉碱的水平要比正常人偏低。理论上虽不会发病，但也会表现出轻微的症状，家系Ⅰ先证者姐姐，平时易疲劳，不喜运动。有文献报道，杂合突变携带者不需要治疗，长期随访未经治疗的携带者易患迟发型肥厚性心肌病，但心功能正常[2]。本研究中的杂合突变携带者是否需要治疗还需随访观察。
综上所述，心肌病是全身性肉碱缺乏的主要表现，而心源性猝死是原发性肉碱缺乏的主要死亡原因。早期诊断、规范治疗是决定远期预后的关键。
