感染性疾病起病急、进展快，重症疑难患者病原体复杂，诊断及治疗困难，可危及生命。早期、准确地明确致病病原微生物对感染判定至关重要，有助于改善预后。当前，病原微生物检测技术层出不穷，能识别的微生物种类越来越多，但如何正确利用和分析微生物检测结果仍是临床关注的难题。值得注意的是，感染首先是个临床诊断，所有的判定必须基于临床。文章将概述病原微生物检测在临床感染判定中的作用，以期帮助临床医生提高认识。
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病原微生物是指可以侵犯人体，在宿主中生长繁殖、释放毒性物质等引起机体不同程度病理变化、发生感染的微生物，包括细菌、病毒、真菌、寄生虫、衣原体、支原体等。病原微生物检测并非新领域，基于病原学证据的抗感染一直都是临床诊疗的"金标准"。如果能尽早识别致病病原、启动恰当的抗感染方案可改善患者预后，尤其是重症感染者。病原微生物检测在感染判定中意义重大，越来越多的检测技术引入临床，除了传统的检测方法如涂片染色、培养分离、免疫学技术、核酸检测等，还有新兴的二代测序技术(Next-generation sequencing，NGS)等。虽然技术种类繁多、手段层出不穷，但对临床医生而言，如何正确选择、利用病原微生物检测方法、正确解读检测结果，才是临床诊治中的关键。所有对病原微生物检测结果的解读都应基于患者、基于临床。本文的侧重点并非概述各种病原微生物检测技术的原理及方法，而系如何利用不同的病原微生物检测技术协助感染判定。
不同病原微生物检测技术对感染的判定价值不同。临床医生应根据患者的病情、可能感染部位、可供采集的标本等选择适宜的检测技术。
当前，随着病原微生物检测技术的快速发展，传统的涂片技术似乎有被忽视的迹象。但涂片技术仍是细菌、真菌检查的最经典方法，其操作简单、快速，有一定的诊断敏感性和特异性。这种形态学检查对临床判定感染、快速获得病原学依据有不可替代性。通过涂片可首先了解标本是否合格，如痰涂片。不合格的标本无须再行培养，因为培养阳性可能误导临床。一般地，除了血液及粪便标本外，培养标本都应做涂片镜检(血培养阳性报警后必须涂片)；如镜检直接发现细菌或真菌菌丝、孢子，可考虑细菌、真菌感染。涂片结合染色分析更为准确，革兰染色检测普通细菌，抗酸染色检测抗酸杆菌，弱抗酸染色检查奴卡菌，10%KOH和(或)乳酸棉酚兰染色检查真菌，墨汁染色检查脑脊液中新型隐球菌，六胺银染色检查呼吸道标本中的肺孢子菌[1]。
培养分离虽耗时长、检出阳性率较低、获得病因证据相对困难，但仍是病原微生物检测的核心方法之一[2]。其优势在于一方面培养分离出的是活微生物，非死菌，有助于确定致病病原菌。因核酸检测等分子生物学技术易受DNA气溶胶污染出现假阳性；菌体死亡后核酸仍可持续残留在机体内，此时行核酸检测亦能获得阳性结果。有研究显示，部分病原微生物感染后动态监测DNA携带时间可持续6个月以上[3]。如果无法区分病原微生物是否具有活性，则常常会误导临床诊治。另一方面，培养能对阳性病原微生物进行菌种鉴定和药敏试验，提供药物敏感/耐药及最小抑菌浓度等信息，便于指导临床抗感染、避免无效治疗。此外，培养的菌落定量都是基于活菌计数，菌落形成单位(colony-forming units，CFU)可计算活的菌体数量。以呼吸道标本为例，通常认为痰培养细菌菌落计数>106 CFU/ml、支气管肺泡灌洗液菌落计数>104 CFU/ml、经支气管镜防污染毛刷菌落>103 CFU/ml时可考虑为感染[4]；菌落计数≤103 CFU/ml为下呼吸道细菌定植阈值。由于临床中病毒、支原体等培养难度大，目前培养分离技术主要用于细菌、真菌和分枝杆菌。
微生物培养结果阳性不一定提示该微生物为致病微生物，阳性结果要综合患者其他临床数据分析是感染、定植还是污染菌群。如将污染、定植误诊为感染，可致抗生素滥用、耐药菌滋生和播散、住院时间延长、经济负担加重等；反之，对感染掉以轻心、误视为污染或定植，则可能致感染扩散、延误病情[4]。无菌部位标本如血液、骨髓、脑脊液、胸腹腔积液、尿液等培养，排除污染因素后，任何阳性结果都可考虑感染。不同部位行多份血培养检测，如大多数或全部结果均为同一微生物生长，提示血流感染的可能性极高[5]。单份血培养为金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌时也多提示血流感染。如血培养中出现草绿色链球菌(非感染性心内膜炎)、凝固酶阴性葡萄球菌和肠球菌时，则解释较复杂；研究表明上述病原菌导致真正血流感染的比例分别为38%、15%和78%，存在较高污染概率[6]。虽然凝固酶阴性葡萄球菌是血培养中最常见污染菌之一，但对留置导尿管或体内置入仪器的患者而言，血培养凝固酶阴性葡萄球菌阳性需引起重视，不能直接考虑为污染菌。非无菌部位标本检测易受正常菌群影响，除外污染菌和定植菌后，检测到的微生物才能考虑为致病病原体。在分析有菌部位标本如粪便、呼吸道分泌物、各种留置导管中留取的体液时，需熟悉该部位常见的病原谱、定植谱及污染谱。如脑脊液是无菌部位体液且无定植菌，但经皮穿刺采集脑脊液时，皮肤定植菌如凝固酶阴性葡萄球菌、棒杆菌属可能污染脑脊液标本；有中枢引流管时导管流出的脑脊液可能会有定植菌污染。
包括组织培养在内的组织病理检测在感染判定时具有重要意义。如组织切片中发现真菌菌丝和孢子，需考虑存在深部真菌感染；曲霉菌感染常在病理组织中看到45°分支分隔的菌丝；发现粗大无分隔呈直角分支的菌丝应考虑毛霉菌感染；组织细胞内发现酵母细胞常提示组织胞浆菌或马尔尼菲篮状菌感染。组织病理中发现抗酸杆菌、肉芽肿以及干酪样坏死性病变时需高度警惕结核感染。
免疫学技术包括抗原和抗体检测，如酶联免疫吸附试验、免疫荧光检测、免疫印迹法、免疫胶体金法等，可用于检测病毒、细菌及真菌。临床中常采用直接免疫荧光法进行抗原检测，其将标记有荧光素的已知抗体与细胞或组织中的相应抗原反应以发现病原微生物。抗原法是目前临床上呼吸道病毒检测的主流方法，但灵敏度较低、特异性抗体与不同抗原间可产生交叉反应出现假阳性等，故一定程度限制了其在感染诊断中的应用价值[7]。血清IgM抗体通常早于IgG出现，提示近期感染，IgM抗体由阴转阳或双份血清抗体滴度4倍及4倍以上增高有诊断意义。机体感染后产生IgG抗体时间较晚，存在检测窗口期，在体内维持时间较长，故IgG阳性常被认为是既往感染。虽然IgM抗体早于IgG抗体出现，但免疫功能低下者可感染后不产生抗体出现假阴性。
PCR是20世纪80年代发展起来的核酸扩增技术，给病原微生物检测带来革命性变革。原理为通过设计引物、扩增特定微生物核酸进行检测，比以往检测技术快速、灵敏度高、特异性好，不受抗生素影响，有助于感染早期诊断[8]。PCR可用于细菌、真菌、病毒、支原体及结核检测。由PCR衍变的相关核酸扩增技术如荧光定量PCR与数字化PCR技术等可定量测定部分病原微生物[9]。多重PCR检测通过多种引物可同时检测多种病原微生物，对混合感染的诊断具有优势[10]。Thong等[11]报道多重PCR检测可同时检测鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，其灵敏度和特异度可达100%。另有些商业试剂盒如FilmArray脑膜炎/脑炎试剂盒可同时检测14种常见病原体，包括6种细菌、7种病毒和1种真菌病原体，检测仅需1 h，检测结果与其他方法比较一致性高[12,13]。另有一些PCR检测平台如结核分枝杆菌及利福平耐药快速检测(Xpert MTB/RIF)能直接从原始痰标本中快速、敏感地检出结核分枝杆菌及利福平耐药性[14]，灵敏性为53%，特异性100%，远高于抗酸涂片、结核菌培养[15]。
培养所需时间周期长，细菌生长中位时间为12～36 h，真菌、厌氧菌时间更长，微生物菌种鉴定和抗菌药敏检测则需额外增加48～72 h，故无法早期判定微生物[16]。目前已出现针对培养阳性的标本联合核酸PCR检测方法以提高检测速率。培养阳性的标本根据革兰阳性菌、革兰阴性菌或真菌选择不同种类的PCR试剂盒检测。如革兰阳性细菌试剂盒包含葡萄球菌探针(金黄色葡萄球菌/凝固酶阴性葡萄球菌)、肠球菌探针(肠球菌)等，革兰阴性细菌探针包括大肠杆菌/铜绿假单胞菌/肺炎克雷伯菌等，酵母探针覆盖白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌/克柔念珠菌等。检测时间约为1.5～3.5 h，灵敏性和特异性分别为97%～100%和90%～100%[17,18]。有些PCR法已发展到可区分甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌[19]。
但PCR技术也存在局限性。由于无论病原体是否存活，其DNA总是存在，故PCR技术无法区分病原微生物是否有生命活性[20]，也不能明确检测到的病原体核酸是否被表达。PCR技术需设计引物进行测序，故仅能检测已知病原体或基因是否存在。PCR不能反映所有病原体的药物敏感/耐药，这一点无法取代培养。
二代测序(NGS)也称为高通量测序，可1次对成千上万到数十亿DNA片段进行序列测定。mNGS是以NGS为基础对样本中的全部微生物DNA进行高通量测序，然后与数据库比对分析，能无偏倚地在同一样本中同时检测细菌、真菌、病毒、寄生虫等。目前已纳入病原体8 000多种，包括3 000余种细菌、4 000余种病毒、200余种真菌和140种寄生虫。mNGS的优势为可对不明原因的感染性疾病、疑似感染但传统检测方法阴性者、免疫功能低下者(如肿瘤、移植、免疫缺陷者)及重症感染者行微生物检测，甚至发现罕见病原微生物[21]。美国一项纳入8家医院57例神经系统感染者的研究显示，与培养、PCR、免疫分析等检测相比，有13例(22%)既往病原学检测阴性者采用mNGS检测后能鉴定出病原体[22]。mNGS检测同样可用于已启动抗感染治疗的患者，提高培养阴性脓毒症患者的病原微生物检出比例[23]。针对免疫功能低下患者的研究发现，mNGS细菌、病毒检出率显著高于传统方法[21]。
mNGS因其技术的无偏倚性几乎可识别临床标本的所有病原，但其本身无法解决阳性结果的解读、明确检测出的病原体是否与疾病相关等。标本采集与实验室检测过程中，很难避免标本污染和(或)混入微生物基因序列，例如细针穿刺时皮肤菌群污染或下呼吸道标本采样时污染口腔菌群等。更为困难的是测序后从背景菌、定植菌、污染菌中分辨出真正的致病菌。到目前为止，并无统一的评判标准或行之有效的分析软件可辅助确认真正的致病微生物。无菌部位标本(如血液、关节腔液、脑脊液样本)的结果解读比非无菌部位标本(如呼吸道样本)更容易。与其他分子生物诊断技术相似，mNGS仍无法明确检测到的序列是否有生命活性。值得关注的是，针对健康人群的NGS检测也有发现细菌核酸的报道，故临床医生需重视标本潜在的污染问题及血液DNA检测阳性所提示的真实内涵[24]。故mNGS检测出的病原体须结合患者临床情况并辅以其他实验室检测方法以验证或佐证，如PCR、特异性血清学检测或病理检测等[25]。
病原微生物检测结果阳性，并不意味着患者一定存在感染或感染一定由检出的病原体所致，需结合标本质量、采集部位、病史及其他检测结果综合分析。不同部位标本检测出同一种病原体，其代表的临床意义可能并不相同。以草绿色链球菌为例，感染性心内膜炎患者血培养阳性与肺部感染者支气管灌洗液培养阳性时，前者会考虑为血流感染而后者很可能被认为定植菌。同样，检测结果阴性也不能完全否定病原体感染的可能，仍需结合标本质量、选择的检测方法是否得当、采集时机、患者临床特点等判断。因病原微生物种类不同，微生物检测方法的选择也不相同；即便检测同一种微生物，因采集部位不同所选择的检测方法也有所差别。如大肠埃希菌，血培养阳性时需考虑血流感染，怀疑致病性大肠埃希菌感染肠道时需特殊培养或者血清学、PCR检测等。因普通大肠埃希菌可寄居在肠道中，粪便普通培养有大肠埃希菌生长并不能直接考虑大肠埃希菌肠道感染。
如前所述，当疑似感染时，必须结合病史、临床症状、体征、其他检测结果、送检时机、怀疑病原学微生物的种类、基础疾病等综合考虑，选择适宜的检测方法。面对特殊、重症、疑难患者应联合多种检测方法。微生物分离培养需依赖病原体活力，不同微生物需不同培养基和培养条件。儿童厌氧菌菌血症比例远低于成人，多数患儿血培养无需行厌氧菌培养，但高危人群(免疫低下、腹腔感染等)仍需要。呼吸道分泌物培养应同时进行细菌和真菌培养。病毒、真菌、寄生虫等病原行免疫学检查时应注意抗原、抗体产生的窗口期，不恰当的采样时间会使假阴性的概率增加。抗原、抗体检测阳性时，尚要关注患者临床表现是否与之相符，因抗体间的交叉反应可致假阳性。处于免疫抑制状态的患者血清特异性抗体检测特异性和敏感性均低于免疫功能正常者，此时抗原、抗体诊断价值有限。
mNGS虽能检测8 000多种病原体，但mNGS阴性结果并不能除外感染可能，mNGS仍有漏检可能。mNGS检测到核酸后与数据库进行比对，根据比对到的序列信息判断样本包含的微生物，可能遗漏未知或罕见的未入库病原微生物。因RNA转录复杂且易降解，mNGS在检测RNA病毒时存在一定困难[26]；另由于胞内感染菌释放到体液中的含量低使其检测敏感性偏低，部分细胞壁较厚的真菌由于核酸提取效率低使得检出率和敏感性较低[27]。尚应注意虽病原微生物的分子诊断技术在不断进步，但目前细菌和真菌的分子生物学检测仍不能取代传统的培养，因为分离培养的菌种可提供抗生素敏感性检测。
无论病原微生物检测结果为阳性或阴性，均需结合临床分析和解释。从传统的培养分离到日益被重视的NGS，对检测结果的解读均基于送检标本的质量。一份不合格的标本，无论得到何种结果均不具有可靠性。为保证结果可靠，所有微生物标本应确保被妥善管理，包括标本类型的选择、采集、运输和储存[28]。合格标本是判定有无感染的前提，只有合格标本才能为临床医生提供准确的信息。
采集标本时需要注意以下几方面[29]：(1)使用抗生素前应尽可能采集标本，一旦开始使用抗生素，微生物群和病原体可受影响，误导检测结果。(2)质量差的标本应予作废。痰涂片见扁平鳞状上皮细胞≥10个/低倍镜视野提示标本质量差，咳痰标本镜检超过40个视野未见菌体，不建议再行普通细菌培养。采集方法不当的尿液标本也应作废(如尿袋尿液、长期留置尿管尿液)。(3)尽量避免"背景菌"影响。身体多个部位存在正常的共生微生物群，这些微生物群易污染不恰当采集的标本，使检测结果复杂化。表面伤口/溃疡、瘘管、痰、鼻窦等处的标本尤应注意。(4)涂片及培养标本尽量选择组织、吸引物和体液，不建议首选拭子。因拭子会吸附外来微生物；且拭子接种培养的琼脂平板多不均匀，细菌或真菌很难从拭子纤维转移到培养基上。与组织标本相比，伤口处的拭子培养准确率仅50%左右[30]。呼吸道病毒检测时可采用带刷子的鼻咽拭子。(5)准确标记标本，使结果更具可读性。血液标本应区分经皮还是经导管取血，标明穿刺位置。分泌物、脓液、穿刺液等须明确注明取材部位。尿液区分清洁中段尿、新插导管尿、穿刺尿液。胸腹腔/脑室引流液不等同于胸腹腔积液/脑脊液。缺乏具体部位和临床信息的标本可导致不准确的诊断和不恰当的治疗。
定植容易对感染判定产生混淆。正常生理状态下人体口腔、胃肠道、呼吸道及体表等部位均有少量细菌、真菌存在，患者无感染症状时称为定植菌。当定植菌的致病力改变或机体防御能力下降时，可大量繁殖或被带入机体深部引起感染成为致病菌。临床医生应如何判断所获取的病原体为定植还是感染，是长久以来的难题，且未形成成熟统一的解决方案。
就呼吸道定植菌而言，既往认为可根据菌落数量或菌种拷贝数来判定定植与感染，但结果存在偏差。越来越多的学者认为，临床上判定是定植还是感染，需结合患者症状、体征及其他检查结果综合分析。若患者存在与检测阳性结果相匹配的临床症状和体征，如发热、咳嗽、咳痰等，感染指标升高，肺部出现新发病灶，应考虑感染并给予相应的抗感染治疗。如仅培养阳性，患者无任何感染相关临床表现，则倾向于定植菌。念珠菌可广泛定植于呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道，正常屏障破坏、免疫功能受损或局部菌群失调时，定植的念珠菌可生长繁殖引起感染。痰和尿标本中分离出的念珠菌亦应根据临床症状和体征鉴别是定植还是感染，念珠菌血培养阳性时要高度警惕念珠菌血症。另定植菌的判断还应参考患者所在病区、医院近3年常见的多重耐药定植菌。
病原微生物检测技术快速发展，能识别的微生物种类越来越多，但感染首先是个临床诊断，所有的判定必须基于临床。更快、更准确地判定感染一直都是病原学检测的挑战，不同方法各有优劣。当前，并没有一项技术可通过从标本中识别微生物来直接判定机体是否感染该病原体，甚至依靠检测的阴性结果来排除感染都很难实现。检测技术革新带来的是临床辅助手段的进步和多样化，但病原微生物检测结果的解读和感染的判定不能脱离临床。在诊疗过程中，临床医生始终需要思考3个问题：患者是否存在感染；如果有感染，致病病原体是什么；如何治疗[31]。从临床出发，充分利用现有的病原微生物检测方法和其他实验室检查手段，缜密分析，综合判定，可能对感染做出正确判定。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
