比较不同耐药性鲍曼不动杆菌分泌的外膜泡(OMVs)的毒力。
提取、纯化4株不同耐药性鲍曼不动杆菌(菌株33、3237、B29和10)分泌的OMVs，BCA法定量后，使用不同浓度的OMVs刺激RAW264.7细胞24 h，CCK-8试剂检测OMVs的细胞毒性，q-PCR法检测细胞因子，包括肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-1β、角化细胞源性生长因子(KC)和巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)的表达，并采用单因素方差分析进行统计学比较。
药敏试验结果显示，菌株10为泛耐药鲍曼不动杆菌(XDRAB)，菌株B29为多重耐药鲍曼不动杆菌(MDRAB)，而菌株33和3237为非MDRAB。将不同浓度OMVs与RAW264.7细胞共孵育24 h后，细胞存活率随着OMVs浓度增加而降低。其中，菌株10、B29、3237产生的OMVs在5 μg/mL时可引起明显的细胞死亡，而菌株33产生的OMVs毒力明显低于其他菌株，在25 μg/mL时细胞存活率仍未见明显降低。4株鲍曼不动杆菌分泌的OMVs均能刺激RAW264.7细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、KC和MIP-2，且随着OMVs浓度增加，细胞因子的表达水平也增加。菌株33分泌的OMVs促炎能力最低，菌株10分泌的OMVs促炎能力最高，且在5 μg/mL时，菌株10产生的OMVs促进KC、MIP-2表达的能力急剧上升，明显高于其他菌株(F＝19.094和19.032，P<0.05或<0.01)。
不同耐药性鲍曼不动杆菌分泌的OMVs毒力各不相同，其中泛耐药和多重耐药菌株分泌的OMVs具有较强的细胞毒力以及促炎能力。
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鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)是一种非发酵革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界中，为条件致病菌，能够在人类皮肤上定植，是引起社区及医院感染的重要病原菌。皮肤或呼吸道完整性被破坏、免疫功能低下的患者对其易感，可引起肺部、皮肤、软组织、神经系统等感染[1]。近年来，多重耐药、泛耐药鲍曼不动杆菌在全球范围内流行，给临床治疗带来极大的困难。流行病学研究结果显示，多重耐药鲍曼不动杆菌(Multidrug-resistant A. baumannii，MDRAB)感染者的病死率高于非MDRAB感染者[2,3]，而菌株的毒力则成为两者病死率差异的一个重要因素。
外膜泡(Outer membrane vesicles，OMVs)是鲍曼不动杆菌分泌的天然产物，为封闭、球形的脂质双分子层结构，其中包含多种致病因子，如蛋白质黏附素、外膜蛋白A(ompA)和脂多糖(LPS)等[4]。OMVs可以传递致病因子至宿主细胞引起细胞死亡，不需要细菌与宿主细胞直接接触，还可以作为宿主天然免疫的有效激活物，参与病原体炎症反应及宿主的天然免疫过程[5]。为此，本研究比较了4株不同耐药性鲍曼不动杆菌分泌的OMVs的毒力，以探究鲍曼不动杆菌耐药性与其致病力之间的关系。
连续收集2013年3至6月中山大学附属第三医院各科室送检的临床样本，并分离出4株鲍曼不动杆菌，分别为菌株33、菌株3237、菌株B29、菌株10(菌株10收集自中山大学附属惠州医院综合ICU)。所有菌株经法国生物梅里埃公司的Vitek 2 Compact鉴定后行PCR扩增OXA-51确认为鲍曼不动杆菌。
小鼠巨噬细胞RAW264.7，由中山大学医学院寄生虫学教研室保存、惠赠。
采用Kirby-Bauer纸片扩散法及E-test法检测菌株对头孢噻肟、阿米卡星、亚胺培南、多黏菌素B、环丙沙星、哌拉西林、替加环素的敏感性。药敏试验结果判读按美国临床实验室标准化研究所(CLSI)2013年版标准[6]，泛耐药(Extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii, XDRAB)与多重耐药菌的定义见文献[7]。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853。Kirby-Bauer纸片扩散法使用的药敏纸片购自北京中诺泰安科技有限公司，E-test法使用的药敏试纸条购自法国生物梅里埃公司。
M-H培养基购自广东省江门市凯林贸易有限公司，Apa I购自TaKaRa公司。使用1% SeaKem Gold∶1%SDS琼脂糖将细菌制胶后，细胞裂解4～5 h，清洗胶块。用Apa I酶切胶块内DNA，然后加样至由0.5×TBE配制PFGE级胶。电泳条件为：起始转换时间(Initial switch time)＝5.0 s，最终转换时间(Final switch time)＝ 20.0 s，线性，电压6 V/cm，电泳时间为19 h。电泳结束后，EB染色，获取图像。
将过夜培养的鲍曼不动杆菌接种至500 mL的LB液体培养基，37℃，250 r/min，震荡培养至A600≈1.0，6 000×g离心15 min，取上清液经0.22 μm滤器过滤。取滤液用100 000 Millipore离心管超滤后，使用超速离心机150 000×g离心2 h，沉淀用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，并再次用0.22 μm滤器过滤后铺LB固体培养板，确定无细菌生长后，BCA法对提取的OMVs进行蛋白定量。
取5 μL溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)的OMVs滴至有膜的铜网上，经0.5%醋酸双氧铀负染后，使用JEM-100CX Ⅱ透射电镜观察拍照。
将小鼠巨噬细胞RAW264.7消化计数后铺至96孔板，2×104个细胞/孔，待细胞完全贴壁后，加入用PBS稀释至不同浓度的OMVs(1～25 μg/mL)，以PBS组为实验对照。置37℃，5%CO2培养箱孵育24 h后，每孔加入10 μL CCK-8 (5 mg/mL)，37℃孵育3 h，酶标仪检测A450值，计算细胞存活率。
将RAW264.7消化计数后铺至24孔板，2.5×105个细胞/孔，加入不同浓度OMVs刺激24 h后，Trizol法提取总RNA，取1 μg总RNA反转录后，将得到的cDNA稀释十倍进行q-PCR实验，以Actin为内参基因，实验结果采用2-ΔΔCt计算。Actin、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-1β、角化细胞源性生长因子(KC)和巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)基因使用的引物见表1。使用ReverAid第一链合成试剂盒(Thermo，美国)行反转录，荧光染料为KAPA SYBR FAST qPCR Kits(Kapa Biosystems，美国)，引物设计参照Ellis等[8]的报道，由上海英骏生物技术有限公司合成，仪器为LightCycler 480(Roche，美国)。
q-PCR引物序列
q-PCR引物序列
| 检测基因 | 引物序列(5'-3') |
|---|---|
| Actin | 上游：AGAGGGAAATCGTGCGTGAC |
| 下游：CAATAGTGATGACCTGGCCGT | |
| TNF-α | 上游：ACCACTCTCCCTTTGCAGAACTCA |
| 下游：TCTCATGCACCACCATCAAGGACT | |
| IL-6 | 上游：TGGCTGAAAAAGATGGATGCT |
| 下游：TCTGCACAGCTCTGGCTTGT | |
| IL-1β | 上游：CCTGTCCTGCGTGTTGAAAGA |
| 下游：GGGAACTGGGCAGACTCAAA | |
| KC | 上游：AGTGTTGTCAGAAGCCAGCGTTCA |
| 下游：ACCCAAACCGAAGTCATAGCCACA | |
| MIP-2 | 上游：TCCATGAAAGCCATCCGACTGCAT |
| 下游：ACATCCCACCCACACAGTGAAAGA |
使用SPSS 18.0软件进行统计分析，方法是连续型变量的交互作用分析后行各个因素/水平下的单因素方差分析(One way AVONA)，其中多重比较采用Bonferroni法，P<0.05为差异有统计学意义。
药敏试验结果显示，菌株33和3237对阿米卡星、亚胺培南、多黏菌素B、环丙沙星、哌拉西林、替加环素均敏感，仅对头孢噻肟耐药；菌株B29对替加环素及多黏菌素B敏感，对其他所测的抗菌药物均耐药；菌株10仅对多黏菌素B敏感，对其他所测的抗菌药物均耐药(表2)。菌株10为XDRAB，B29为MDRAB。
4株临床分离鲍曼不动杆菌的药敏试验结果[药敏(抑菌圈直径，mm)]
4株临床分离鲍曼不动杆菌的药敏试验结果[药敏(抑菌圈直径，mm)]
| 菌株 | 阿米卡星 | 亚胺培南 | 多黏菌素B | 环丙沙星 | 哌拉西林 | 头孢噻肟 | 替加环素a |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 菌株33 | S(19) | S(24) | S(12) | S(24) | S(18) | R(15) | S(0.75) |
| 菌株3237 | S(21) | S(28) | S(12) | S(24) | S(17) | R(14) | S(0.75) |
| 菌株B29 | R( 0) | R( 0) | S(12) | R( 0) | R( 0) | R( 0) | S(1 ) |
| 菌株10 | R( 0) | R( 0) | S(12) | R( 0) | R( 0) | R( 0) | R(8 ) |
注：a药敏(最低抑菌浓度，mg/L)；S.敏感；R.耐药
差异小于3个条带者为同源性高，差异大于6个条带者为同源性低。PFGE示，菌株10与B29同源性高，菌株33和3237同源性低(图1)。
注：M. DNA标记；1～4.菌株10、33、3237、B29
将纯化的OMVs行透射电镜，可见鲍曼不动杆菌产生的OMVs为完整的圆形或椭圆形结构，直径为30～140 nm(图2)。各菌株产生的OMVs形态未见明显差异。
将不同浓度OMVs与RAW264.7细胞共孵育24 h后，CCK-8实验显示，细胞存活率随着OMVs浓度增加而降低。菌株10、B29、3237产生的OMVs在5 μg/mL时可引起明显的细胞死亡，而菌株33产生的OMVs毒力明显低于其他菌株，在25 μg/mL时细胞存活率仍未见明显降低(图3)。
注：图示为3次重复实验结果
4株鲍曼不动杆菌分泌的OMVs均能刺激RAW264.7细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、KC和MIP-2，且随着OMVs浓度增加，细胞因子的表达水平也增加。菌株33分泌的OMVs促炎能力最低，菌株10分泌的OMVs促炎能力最高，且在5 μg/mL时，菌株10产生的OMVs促进KC、MIP-2表达的能力急剧上升，明显高于其他菌株(F＝19.094和19.032，P<0.05或P<0.01)(图4)。
注：aP<0.05；bP<0.01；IL.白细胞介素；TNF-α.肿瘤坏死因子α；KC.角化细胞源性生长因子；MIP-2.巨噬细胞炎性蛋白2
鲍曼不动杆菌曾经被认为是一种毒力相对较低的条件致病菌，但越来越多的证据表明，即便在考虑了疾病严重程度及抗菌药物的经验性使用等混杂因素以后，鲍曼不动杆菌感染仍然与患者病死率的升高有关[9]。早在2004年，一个大型多中心研究报道鲍曼不动杆菌血流感染者的病死率就已经达到34%，而ICU患者病死率则达到了43.4%[10]。近年来，耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(Carbapenem-resistant A. baumannii，CRAB)的流行加重了患者的临床结局，CRAB的感染往往比碳青霉烯类敏感的鲍曼不动杆菌(Carbapenem-susceptible Acinetobacter baumannii，CSAB)感染的患者具有更高的病死率[11]。然而，目前缺乏证据证实耐药性与病死率之间是否具有确切的联系，细菌的基因型、不恰当的治疗方式、疾病的严重程度、碳青霉烯类耐药及耐药机制等均可能是患者死亡的危险因素[3]。因此，鲍曼不动杆菌耐药性与毒力之间的关系是本研究关注的问题。
已有研究表明，β-类酰胺类耐药机制相关的ompA、CarO蛋白、外排泵AdeABC，以及喹诺酮类和多黏菌素类抗菌药物的耐药性改变都可以影响鲍曼不动杆菌的毒力及适应性[12]，并且大多数耐药性的获得似乎都伴随着细菌适应性和毒力的下降[13,14,15]。然而，也有一些相悖的报道出现，Durante-Mangoni等[16]发现长时间使用多黏菌素诱导耐药的鲍曼不动杆菌其适应性和毒力均未下降。同时，需要注意的是，通过抗菌药物诱导细菌耐药来研究耐药性与毒力、适应性的关系依然有别于细菌在环境及宿主中的进化过程。本实验使用的OMVs是革兰阴性菌分泌的天然产物，研究表明鲍曼不动杆菌OMVs可通过传递耐药基因、传递生物酶、影响生物膜形成等过程而与耐药性相关[17,18]，还可以通过传递致病因子如LPS、ompA等，参与病原体炎症反应及宿主的天然免疫过程。因此，OMVs是一种与细菌耐药性与毒力均相关的天然复合物。
本研究收集临床菌株后，行脉冲场凝胶电泳和药敏测试，并从中挑取了不同脉冲场型及不同耐药谱的4株鲍曼不动杆菌，其中菌株10为XDRAB，B29为MDRAB，两者都对碳青霉烯类耐药，菌株33、3237则都是碳青霉烯类敏感的非MDRAB。分别提取OMVs行细胞毒力实验，所有菌株产生的OMVs毒力均随着浓度的增加而增加，菌株B29、10、3237的细胞毒力均高于菌株33，尽管菌株33和3237均为碳青霉烯类敏感的非MDRAB，但菌株3237分泌OMVs的毒力却明显高于菌株33，可能是由于基因型的不同所致。有趣的是，菌株B29和10无论细胞毒力还是促细胞因子表达的能力均保持在较高水平，尤其是菌株10，在OMVs浓度达到5 μg/mL时，细胞因子IL-6、KC、MIP-2表达水平明显高于其他菌株，因而可能导致严重的临床结局。
OMVs组成复杂，包含有LPS、ompA等诸多毒力因子。在前期的研究中，我们对一株MDRAB菌株A38和非MDRAB菌株5806分泌的OMVs进行了蛋白质谱对比，发现A38的OMVs中包含了更多的毒力相关因子，如ompA、EpsA、Ptk、GroEL等[19]，可以诱导RAW264.7细胞产生更强的细胞毒力，本实验观察结果与之相符，从而进一步说明XDRAB和MDRAB分泌的OMVs可能比非MDRAB分泌的OMVs具有更强的细胞毒力及促炎能力。
由于本研究只对4株菌株进行了对比，没有覆盖碳青霉烯类敏感的MDRAB，且缺少体内试验，实验结果具有一定的局限性。同时，导致各菌株间毒力差异的靶蛋白尚不可知。在A38和5806所有差异表达的蛋白里面，ompA是目前研究得最确切的毒力因子，但ompA却不是OMVs诱导产生促炎反应的主要因素，OMVs的表面蛋白发挥了更重要的作用[5]，而究竟是哪种表面蛋白起了主要作用，是否又与细菌的某种耐药性有关，还需要进一步的探索研究。
此外，最近的研究发现共生菌产生的OMVs在支持宿主免疫系统成熟中发挥了重要的作用[20]，而病原菌产生的OMVs可以促进感染的发生和宿主的炎症反应，还可以通过抑制炎症反应调节免疫系统，从而促进细菌在宿主细胞中的生存[21]。鉴于不同耐药性鲍曼不动杆菌产生的OMVs毒力不同，其在细菌与宿主相互作用，尤其是在定植与感染的角色转变中发挥的作用值得进一步研究。
利益冲突 无
