了解杭州地区Saffold心病毒(SAFV)在急性呼吸道感染(ARI)患儿中的临床特征和流行病学特征。
收集2011年3月至2014年2月浙江大学医学院附属儿童医院呼吸道门诊和住院病例共1 060例。其中门诊病例采集咽拭子256份，住院病例采集气管吸取物804份。实时荧光PCR扩增SAFV的5’UTR基因片段。采用SPSS 17.0软件分析检测结果和临床资料。
ARI门诊患儿和住院患儿样本中SAFV的检出率分别是2.3%(6/256)和13.2%(106/804)，两者相比差异具有统计学意义(χ2＝24.147，P<0.01)。住院病例中，<1岁、1～<3岁、3～<6岁和6～12岁患儿阳性检出率分别为14.0%、11.2%、11.1%和8.3%，各年龄组间相比，差异无统计学意义(χ2＝1.845，P>0.05)；男性和女性患儿SAFV检出率分别为12.7%和17.7%(χ2＝0.279，P>0.05)；按季节划分，SAFV检出率最高的是秋季(21.2%)，其次是春季(14.6%)，冬季(9.5%)和夏季(8.8%)检出率相对较低(χ2＝15.625，P<0.01)。106例SAFV阳性住院患儿中，81例存在合并感染，合并感染率为76.4%。6例门诊病例中，4例存在合并感染，合并感染率为66.7%。住院病例中，与SAFV合并感染率最高的是呼吸道合胞病毒(36.8%)，其次为鼻病毒(27.4%)、偏肺病毒(10.4%)和副流感病毒(10.4%)。ARI患儿中，SAFV阳性病例的发热率低于SAFV阴性病例(χ2＝4.069，P<0.05)。
杭州地区ARI住院患儿中SAFV的检出率显著高于门诊患儿，SAFV感染均以合并感染为主。SAFV在杭州地区的流行呈现一定地方流行模式。
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Saffold心病毒(SAFV)属于微小核糖核酸病毒科，心病毒属，是一种无包膜的单股正链RNA病毒。该病毒于1981年首次从一例不明原因发热的婴儿粪便中被分离。其对温度敏感，在酸性条件下稳定，可在人胚肾二倍体细胞中生长，在乳鼠中增殖，而在原代猴肾细胞、人肺腺癌系细胞(A-549)、非洲绿猴肾细胞(BSC)和人横纹肌肉瘤细胞中不生长。直到2007年才完成对该病毒序列测定，证实与心病毒属的泰勒病毒(Thtilovirus)相近，确定为心病毒属中感染人类的新种，命名为Saffold心病毒[1]。SAFV感染的临床表现较为复杂，主要为消化道、呼吸道和中枢神经系统感染[2,3,4,5,6]。Nielsen等[7]和Ito等[8]的最新研究发现，SAFV还与人心肌炎和胰腺炎有关。目前已证实可从人多种组织部位的样本中检测到SAFV，如呼吸道或消化道感染患儿的鼻咽分泌物和粪便，无菌性脑膜炎患儿的脑脊液，心肌炎患儿的心肌、肺组织和血液等[1,2,3,4,5,6,7,8]。SAFV普遍存在，呈全球性分布，因其感染的系统广泛性及高流行率，其与临床疾病之间的关系成为近年的研究热点。目前，国内对SAFV的研究主要集中在不同病例样本中SAFV的检测情况分析，SAFV在急性呼吸道感染(ARI)中的流行病学特征和临床意义有待更进一步的研究。因此，我们对杭州地区ARI患儿进行了SAFV的监测，旨在了解其在ARI中的临床症状和流行特征，为临床诊断和治疗SAFV感染患儿提供依据。
收集2011年3月至2014年2月杭州地区0～12岁ARI患者样本共1 060份。每周于浙江大学医学院附属儿童医院采集ARI住院患儿呼吸道吸出物样本共804份。ARI住院病例定义参考文献[9]。同时于该院儿科门诊采集ARI患儿咽拭子样本共计256份。ARI门诊病例为流感样病例。样本采集后送本中心实验室，于－80℃冰箱存放待测。
使用QIAGEN RNeasy mini kit(74104)提取病毒RNA。实验操作步骤严格按说明书进行，取200 μL样本，加入到600 μL样本裂解液中，最后将核酸溶解于50 μL的ddH2O中。使用PrimeScript™ Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara，6210A)进行反转录，反应体系为：1 μL 50 ng/μL的6碱基随机引物，1 μL dNTP(10 mmol/L)，8 μL RNA，混匀置65℃ 5 min，冰上迅速冷却。再加入反应液：4 μL 5×PrimeScript Ⅱ Buffer，0.5 μL Rnase Inhibitor(40 U/μL)，1μL Prime Script Ⅱ Rtase(200 U/μL)，ddH2O 4.5 μL。30℃ 10 min，42℃ 60 min进行反转录反应，70℃ 15 min灭活酶，置冰上冷却。cDNA保存于-30℃冰箱。SAFV实时PCR检测：荧光定量PCR仪为ABI公司产品，型号为ABI 7300。SAFV引物探针见参考文献[10]，由上海超世生物科技有限公司合成。运用实时荧光定量PCR方法对SAFV 5’UTR端基因片段进行扩增。取1 μL cDNA为模板，扩增使用Ex Taq酶(Takara，DRR001A)，反应体积为20 μL，含1×buffer、MgCl2 3 mmol/L、dNTPs各0.2 mmol/L、引物各0.4 μmol/L、探针各0.2 μmol/L、Ex Taq酶25 U/mL。反应条件：50℃ 2 min；95℃ 2 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s，60℃ 45 s，45个循环。于60℃检测通道的荧光信号。CT值<35.0判断为阳性。选择CT值<30.0的实时PCR扩增产物，纯化后送至上海生工进行测序确认，并将确认阳性样本的cDNA作为实时PCR检测的阳性对照。
RNA病毒的检测：取SAFV阳性样本1 μL cDNA为模板，进行呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒(HRV)、流感病毒(FluA，FluB)、副流感病毒1～3型(PIV1～3)、冠状病毒(CoV)(HKU1、OC43、229E和NL63)及偏肺病毒(hMPV)的检测。DNA病毒检测：使用QIAGEN DNA mini kit(51304)提取SAFV阳性样本的DNA，进行腺病毒(ADV)和博卡病毒(HBoV)的检测。报道取样本DNA 2 μL为模板。引物探针参考文献[11,12]。扩增使用Ex Taq酶，反应体系和条件同SAFV实时PCR检测。
应用SPSS 17.0软件进行分析。计量资料用
±s表示，组间比较采用t检验；计数资料用例(百分数)表示，采用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
1 060份ARI患儿中，男性689例，女性371例，共检出SAFV阳性标本112份，阳性检出率为10.6%。ARI门诊患儿中SAFV阳性样本6份，阳性检出率是2.3%(6/256)，住院患儿中SAFV阳性样本106份，阳性检出率是13.2%(106/804)，两者之间差异具有统计学意义(χ2＝24.147，P<0.01)。
6例SAFV阳性门诊患儿中，男性2例，女性4例；年龄最小为1岁，最大为9岁，年龄中位数为6岁；2例在1月检出，2例在2月检出，另有2例分别在3月和6月检出。因阳性病例少，未对其流行病学特征进行统计分析。106例SAFV阳性住院患儿中，男性患儿SAFV检出率为12.7%(66/519)，女性患儿SAFV检出率为17.7%(40/285)，性别相比差异无统计学意义(χ2＝0.279，P>0.05)；年龄最小为1个月，最大为7岁，年龄中位数为6个月，其中<1岁、1～<3岁、3～<6岁和6～12岁患儿阳性检出率分别为14.0%、11.2%、11.1%和8.3%，各年龄组间相比，差异无统计学意义(χ2＝1.845，P>0.05)；按季节划分，SAFV检出率最高的是秋季(21.2%)，其次是春季(14.6%)，冬季(9.5%)和夏季(8.8%)检出率相对较低。四季检出率比较，差异具有统计学意义(χ2＝15.625，P<0.01)。2011年至2013年SAFV均在秋季有流行高峰，其他如2011年的5～6月，2012年3月，2013年1月、4月、7月也出现一定的流行高峰。阳性率最高的月份可达41.7%。见表1和图1。
1 060例急性呼吸道感染患儿中Saffold心病毒检出情况[例(%)]
1 060例急性呼吸道感染患儿中Saffold心病毒检出情况[例(%)]
| 项目 | 门诊病例(n＝256) | 住院病例(n＝804) | |||
|---|---|---|---|---|---|
| 检测样本 | 阳性样本 | 检测样本 | 阳性样本 | ||
| 性别 | |||||
| 男 | 170 | 2(1.2) | 519 | 66(12.7) | |
| 女 | 86 | 4(4.7) | 285 | 40(17.7) | |
| 年龄(岁) | |||||
| <1 | 72 | 0 | 598 | 84(14.0) | |
| 1～<3 | 94 | 1(1.1) | 134 | 15(11.2) | |
| 3～<6 | 53 | 2(3.8) | 36 | 4(11.1) | |
| 6～ 12 | 37 | 3(8.1) | 36 | 3( 8.3) | |
| 季节 | |||||
| 春季(3～5月) | 72 | 1(1.4) | 233 | 34(14.6) | |
| 夏季(6～8月) | 68 | 1(1.5) | 217 | 19( 8.8) | |
| 秋季(9～11月) | 60 | 0 | 165 | 35(21.2) | |
| 冬季(12～2月) | 56 | 4(7.1) | 189 | 18( 9.5) | |
6例SAFV阳性门诊患儿中，4例存在合并感染，合并感染率为66.7%。其中合并2种病原体感染3例，合并3种病原体感染1例。106例SAFV阳性住院患儿中，81例存在合并感染，合并感染率为76.4%。其中，合并2种病原体感染58例，合并3种病原体感染17例，合并4种病原体感染6例。与SAFV合并感染率最高的是RSV，为36.8%(39/106)，其次为HRV，阳性率为27.4%(29/106)。hMPV和PIV在SAFV阳性住院患儿中也具有较高的感染率，均为10.4%(11/106)。合并2种病原体感染中，最常见的为RSV＋SAFV，为24例，其次是HRV＋SAFV和PIV＋SAFV，分别为18例和8例。合并3种病原体感染中，除3例RSV＋HRV＋SAFV合并感染，2例RSV＋hMPV＋SAFV和2例RSV＋FLU＋SAFV合并感染外，其他合并感染组合均是单个病例。而合并4种病原体感染中，除2例SAFV＋RSV＋HRV＋PIV外，其他病原组合均不相同。合并感染情况详见表2。
杭州市急性呼吸道感染患儿Saffold心病毒(SAFV)与其他呼吸道病毒合并感染分布[例(%)]
杭州市急性呼吸道感染患儿Saffold心病毒(SAFV)与其他呼吸道病毒合并感染分布[例(%)]
| 合并其他病原体感染 | 门诊SAFV阳性病例(n＝6) | 住院SAFV阳性病例(n＝106) |
|---|---|---|
| RSV | 0 | 24(22.6) |
| HRV | 0 | 18(17.0) |
| PIV | 0 | 8( 7.5) |
| hMPV | 0 | 3( 2.8) |
| FLU | 2(33.3) | 2( 1.9) |
| ADV | 1(16.7) | 1( 0.9) |
| HBoV | 0 | 2( 1.9) |
| RSV＋HRV | 0 | 4( 3.8) |
| FLU＋RSV | 0 | 2( 1.9) |
| RSV＋hMPV | 0 | 2( 1.9) |
| PIV＋HRV | 0 | 1( 0.9) |
| hMPV＋ADV | 0 | 1( 0.9) |
| HRV＋HBoV | 0 | 1( 0.9) |
| FLU＋hMPV | 1(16.7) | 1( 0.9) |
| FLU＋HBoV | 0 | 1( 0.9) |
| RSV＋PIV | 0 | 1( 0.9) |
| RSV＋COV | 0 | 1( 0.9) |
| PIV＋hMPV | 0 | 1( 0.9) |
| HRV＋hMPV | 0 | 1( 0.9) |
| RSV＋HRV＋PIV | 0 | 2( 1.9) |
| RSV＋HRV＋HBoV | 0 | 1( 0.9) |
| RSV＋FLU＋ADV | 0 | 1( 0.9) |
| RSV＋hMPV＋HBoV | 0 | 1( 0.9) |
| HRV＋FLU＋hMPV | 0 | 1( 0.9) |
注：RSV.呼吸道合胞病毒；ADV.腺病毒；HRV.人鼻病毒；HBoV.博卡病毒；hMPV.偏肺病毒；PIV.副流感病毒；FLU.流感病毒；COV.冠状病毒
住院患儿中，男性患儿合并感染率为78.8%(52/66)，女性患儿合并感染率为72.5%(29/40)，两者比较差异无统计学意义(χ2＝0.546，P>0.05)。住院患儿中，<1岁患儿合并感染率为77.4%(65/84)，1～<3岁患儿合并感染率为73.3%(11/15)，3～<6岁和6～12岁组合并感染率分别为75%(3/4)和66.7%(2/3)。各年龄组之间的合并感染率相比，差异无统计学意义(χ2＝0.271，P>0.05)。
1 060例ARI患儿中，共收集到799例病例的临床资料，均为住院病例。SAFV阳性患儿的症状主要为咳嗽(100%，106/106)、发热(44.3%，47/106)、气短或呼吸困难(32.1%，34/106)和X射线显示肺部异常(78.3%，83/106)。SAFV阴性患儿的症状也主要为咳嗽(97.5%，676/693)、发热(54.8%，380/693)、气短或呼吸困难(33.9%，235/693)和X射线显示肺部异常(80.8%，560/693)。其中SAFV阳性患儿的发热率低于SAFV阴性患儿，差异具有统计学意义(χ2＝4.069，P<0.05)。SAFV阳性患儿和阴性患儿在常见并发症和基础疾病方面比较，差异均无统计学意义(P值均>0.05)。详见表3。此外，SAFV阳性患儿中6例(5.7%)诊断为迁延性肺炎，SAFV阴性患儿中为29例(4.2%)，两者相比差异无统计学意义(χ2＝1.552，P>0.05)。
急性呼吸道感染Saffold心病毒(SAFV)住院患儿的临床特征比较[例(%)]
急性呼吸道感染Saffold心病毒(SAFV)住院患儿的临床特征比较[例(%)]
| 临床特征 | SAFV阳性病例(n＝106) | SAFV阴性病例(n＝693) | χ2/t值 | P值 | |
|---|---|---|---|---|---|
年龄(个月， ±s) | 9.0±10.9 | 11.4±15.6 | 1.528 | >0.05 | |
| 性别 | |||||
| 男 | 66( 62.3) | 450(64.9) | 0.287 | >0.05 | |
| 女 | 40( 37.7) | 243(35.1) | |||
| 症状 | |||||
| 发热 | 47( 44.3) | 380(54.8) | 4.069 | <0.05 | |
| 咳嗽 | 106(100.0) | 676(97.5) | 1.609 | >0.05 | |
| 气短或呼吸困难 | 34( 32.1) | 235(33.9) | 0.069 | >0.05 | |
| X射线肺部异常 | 83( 78.3) | 560(80.8) | 0.368 | >0.05 | |
| 并发症 | |||||
| 肺炎 | 97( 91.5) | 598(86.3) | 2.211 | >0.05 | |
| 呼吸衰竭 | 3( 2.8) | 32( 4.6) | 0.339 | >0.05 | |
| 基础疾病 | |||||
| 先天性心脏病 | 8( 7.5) | 73(10.5) | 0.909 | >0.05 | |
| 哮喘 | 1( 0.9) | 21( 3.0) | 0.818 | >0.05 | |
SAFV感染呈全球分布，在急性呼吸道中的感染率为0.5%～12.1%[13,14,15]。本研究中，SAFV在ARI住院患儿样本中的检出率是13.2%，高于之前的报道。门诊患儿中SAFV的检出率是2.3%，与住院患儿相比，差异具有统计学意义，说明杭州地区SAFV主要在急性下呼吸道感染的住院患儿中流行。周琼华等[2]报道的长沙地区住院儿童中SAFV的检出率为10.4%，与该研究结果相近。Lin等[16]报道中国台湾地区的上呼吸道感染儿童中，SAFV-3型的检出率为9.73%，与该研究门诊患儿的上呼吸道感染的检出率差别较大。王维等[17]报道天津地区ARI儿童中SAFV的检出率为11.9%。Zhang等[18]对我国重庆地区的3种病例样本进行了检测比较，手足口病例组的SAFV阳性率显著大于ARI组合腹泻病例组。Itagaki等[14]报道SAFV可引起ARI暴发。2009年和2012至2013年，SAFV在日本Yamagata地区引起了3起暴发。SAFV检出率的差异，可能与样本来源、地区差异、检测方法及当年的流行情况有关。
之前报道SAFV感染多见于6岁以下儿童[2,10,15]。王维等[17]报道天津地区SAFV感染儿童年龄最大为12岁，<1岁感染患儿占阳性患儿的79%。本研究中SAFV感染患儿年龄最大为9岁，SAFV感染患儿以住院患儿为主，住院患儿年龄最小为1个月，年龄中位数为6个月，表明婴幼儿是SAFV的易感人群，与其他报道一致[13,14,15,16,17]，其中<1岁住院患儿SAFV检出率最高，应引起临床重视。目前关于ARI中SAFV感染的高峰季节报道不一。日本Yamagata地区SAFV流行主要在9～11月份[14]。长沙地区的感染高峰主要集中于4～5月份[2]。天津地区SAFV感染高峰为夏、冬季[17]。该研究ARI住院患儿中，连续3年SAFV均在秋季(9～11月)出现流行高峰，与日本Yamagata地区流行高峰一致。SAFV检出率最高的月份达41.7%，远高于之前的报道[2,13,14,15,16,17,18]。但除秋季外，SAFV在杭州地区还出现其他流行高峰，且SAFV在杭州3年的流行情况也不尽相同，呈现出一定地方流行模式。由此推测，SAFV在杭州ARI住院患儿中的流行可能存在一个循环周期，或存在一定的暴发流行。这提示应加强SAFV监测，关注SAFV的流行，特别是暴发流行情况。SAFV的季节分布也与不同地域的地理环境和气候有关，SAFV在杭州确切的分布特征还需要更长时间、更大样本的监测。
该研究ARI患儿感染SAFV均以合并感染为主，与之合并感染最多的是RSV，其次是HRV和PIV。其他合并感染的组合很多，未发现明显的规律性，这或许与我们检测的病原较多有关。住院患儿和门诊患儿合并感染率分别为66.7%和76.4%。周琼华等[2]报道长沙地区SAFV在急性下呼吸道感染中的合并感染率70.2%。该研究中SAFV感染浓度均较低，多为伴随感染，9.0%的SAFV阳性病例CT值<30.0。合并感染的组合很多，这增加了分析SAFV致病性的复杂性。周琼华等[2]对SAFV临床症状的比较中发现，SAFV阳性和阴性病例中，患儿诊断为迁延性肺炎的差异具有统计学意义，而该研究SAFV阳性和阴性病例中，患儿诊断为迁延性肺炎的差异无统计学意义。对ARI住院患儿感染SAFV的临床特征的比较中，发现SAFV阳性病例的发热率显著低于SAFV阴性病例。Itagaki等[14]报道85.7%～92.1%的SAFV单一感染病例存在发烧症状，和该研究不同，这或许是因为样本来源和检测方法的差异而导致统计人群的不同造成的。其采用的是咽炎、咽峡炎和扁桃体炎等ARI样本，采用细胞分离和普通RT-PCR的方法筛检阳性病例；该研究采用的是住院病例急性下呼吸道感染样本，采用实时荧光PCR的方法筛检阳性病例。值得一提的是，该研究所有的SAFV阳性病例临床表现均有咳嗽，但与SAFV阴性病例组相比差异无统计学意义。SAFV是一种心病毒，对81例患有先天性心脏病的病例进行了分析，SAFV阳性患儿与阴性患儿之间的差异也无统计学意义。
综上所述，杭州地区ARI患儿存在SAFV感染，相对其他地区有较高的检出率。此外，ARI病例中SAFV感染浓度较低，且主要以合并感染为主，推测该病毒在儿童呼吸道呈低增殖或持续缓慢增殖状态，提示SAFV在儿童ARI中的伴随感染地位。
利益冲突 无
