分析结核分枝杆菌感染情况下，U937巨噬细胞中miRNA-29a的表达变化及基因的表达调控，揭示miRNA-29a在结核发生发展中的作用机制。
利用miRnada、RNAhybrid和targetscan软件对miRNA-29a的靶基因进行预测。采用卡介苗菌株感染佛波酯(PMA)诱导分化的U937巨噬细胞，提取RNA，逆转录为cDNA。采用实时荧光定量PCR检测miRNA-29a及其靶基因表达水平，并通过构建miRNA-29a过表达和低表达的U937巨噬细胞系，检测miRNA-29a水平及其靶基因的表达水平。采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析。
miRNA-29a调控VEGFA、NFATC3和TSC22D3基因等表达。卡介苗菌株感染U937巨噬细胞后，miRNA-29a表达增加，为正常培养U937巨噬细胞的1.33倍(P<0.05)，VEGFA、NFATC3及TSC22D3基因表达水平也显著升高，分别为正常培养U937巨噬细胞的5.34、99.25及2.12倍(P<0.01)。U937巨噬细胞经miRNA-29a模拟物转染后，VEGFA、NFATC3和TSC22D3基因表达水平分别上调至1.35、1.29和3.38倍(P<0.05或<0.01)，而U937巨噬细胞经miRNA-29a抑制剂转染后，VEGFA、NFATC3和TSC22D3基因表达水平分别下调至0.07、0.08和0.55倍(P<0.01)。
结核分枝杆菌感染可导致U937巨噬细胞miRNA-29a表达水平升高，进一步靶向调控VEGFA、NFATC3和TSC22D3基因表达增加，从而可能参与结核的发生发展。
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结核分枝杆菌是典型的胞内致病菌，其宿主细胞为巨噬细胞。巨噬细胞是机体重要的固有免疫细胞和抗原递呈细胞，同时也是宿主控制结核分枝杆菌感染播散的重要防御屏障，在结核分枝杆菌繁殖和扩散过程中起着关键作用[1]。结核分枝杆菌进入巨噬细胞后，大部分可被细胞消化清除，但一些可通过诸多逃逸机制避免机体的杀伤，并在细胞内存活繁殖[2]。感染导致的不同结局可能取决于细菌的毒力以及细胞免疫功能的具体状态。MicroRNA(miRNA)是一类高度保守的短链非编码调控单链RNA，其功能和作用的研究已成为近年来的焦点。MiRNA-29a在之前的研究中被发现参与肿瘤形成、免疫炎症反应、细胞因子分泌和糖类代谢等过程，同时也与结核分枝杆菌、呼吸道合胞病毒和HIV病毒等感染相关[3,4]。目前miRNA-29a所调控的靶基因仍未完全明确，本研究利用miRnada、RNAhybrid和targetscan软件对miRNA-29a的靶基因进行预测，发现miRNA-29a调控VEGFA、NFATC3和TSC22D3等基因表达。该研究通过检测结核分枝杆菌感染U937巨噬细胞后miRNA-29a和VEGFA、NFATC3和TSC22D3基因的表达变化，以及过表达miRNA-29a或敲降miRNA-29a后巨噬细胞中VEGFA、NFATC3和TSC22D3基因的表达变化，探讨miRNA-29a与VEGFA、NFATC3和TSC22D3基因之间的相互关系，以及miRNA-29a参与调控结核分枝杆菌感染及免疫过程的作用机制。
RNAiso Plus Total RNA提取试剂盒(Takara公司，大连)；RNase Inhibitor(全式金生物科技有限公司，北京)；PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara公司，大连)；SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(索莱宝科技有限公司，北京)；胎牛血清(Thermofisher公司，美国)；RMPI 1640培养液(Thermofisher公司，美国)；Lipofectamine 2000转染试剂(Thermofisher公司，美国)；卡介苗(上海市公共卫生临床中心)；U937细胞(齐氏生物科技有限公司，上海)；miRNA-29a模拟物和miRNA-29a抑制剂(上海吉荧生物技术有限公司)。
根据序列互补性、序列保守性及热动力学因素等原则，利用miRnada(http：//34.236.212.39/microrna/home.do)、RNAhybrid(http：//bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)和targetscan(http：//www.targetscan.org/)等软件预测miRNA-29a的靶基因，再利用R软件(https：//www.r-project.org)对三种预测软件获得的靶基因取交集。
取－80℃保存的BCG菌株100 μL加至20 mL 7H9液体培养基中，在37 ℃摇床培养5～10 d，转速150 rpm。每天检测光密度值(A)，待A600达到0.8～1.0时，代表BCG生长至对数生长期。全程无菌操作。
复苏液氮冻存的U937细胞系，加入RMPI 1640完全培养基(含10%胎牛血清，1%链霉素和青霉素)，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养。取对数生长期的U937细胞，以1×106个/孔接种至六孔细胞培养板中，加入含10%胎牛血清、100 ng/mL佛波酯(PMA)的RMPI 1640培养液，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养。48 h后观察细胞贴壁情况，去除培养上清，加入无PMA的RMPI 1640完全培养基进行培养。取PMA诱导分化后的U937细胞(U937巨噬细胞)，以2×106个/瓶接种至T25细胞培养瓶。以感染复数(MOI)为5的比例，接种对数生长期的BCG至U937巨噬细胞培养瓶，于37℃、5% CO2细胞培养箱培养23 h后，离心收集细胞。以未接种BCG的U937巨噬细胞作为对照。
将1×106个U937巨噬细胞接种至六孔细胞培养板，于37℃、5% CO2细胞培养箱培养24 h，取10 μL miRNA-29a模拟物或miRNA-29a抑制剂加入250 μL不含血清和抗生素的培养液进行稀释，取5 μL Lipofectamine 2000转染试剂加入250 μL不含血清和抗生素的培养液混匀，混合上述两种液体，室温放置20 min，将转染复合物加至6孔板，miRNA-29a模拟物或miRNA-29a抑制剂的终浓度为50 nmol/L。培养4 h后换液，继续培养2 d，取细胞检测miRNA-29a及VEGFA、NFATC3和TSC22D3D表达水平。
收集U937巨噬细胞，8 000×g 4℃离心2 min，加入1 mL RNAiso Plus，充分裂解细胞，室温静置5 min，然后加入200 μL氯仿，混合至溶液乳化呈乳白色，室温静置5 min，12 000×g 4℃离心15 min，吸取上层上清液，向上清液中加入1 mL异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min，12 000×g 4℃离心10 min，弃上清液，加入1 mL 75%乙醇，7 500×g 4℃离心5 min，弃上清液，室温干燥沉淀几分钟，加入适量的RNase-free水溶解沉淀。参照Takara公司PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒的说明书进行基因组DNA去除以及cDNA合成，反转录条件为37℃ 15 min，85℃ 5 s。
采用实时定量PCR检测miRNA-29a及VEGFA、NFATC3和TSC22D3D表达水平，以U6、GAPDH为内参，相应引物序列见表1。反应体系为：SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2×)12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1μL，cDNA模板2 μL，ddH2O补足至25 μL。反应条件：95℃预变性30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。实验仪器为ABI 7900实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司，美国)。实验设置3个平行复孔。采用2－△△Ct方法进行数据分析。
实时定量PCR引物列表
实时定量PCR引物列表
| 引物名称 | 序列(5′-3′) |
|---|---|
| miRNA-29a-F | TTGCACCCTCACGACATGCT |
| miRNA-29a-R | TGACTCTCAGCAGGCCTCA |
| U6-F | GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT |
| U6-R | CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT |
| VEGFA-F | GGGCAGAATCATCACGAAGTGGTG |
| VEGFA-R | CTGCATGGTGATGTTGGACTCCTCA |
| NFATC3-F | AAATAAAACCCTCCCCCACC |
| NFATC3-R | GGATAAATGAAGGCAGGACG |
| TSC22D3-F | TGGTGGCCATAGACAACAAG |
| TSC22D3-R | CTCCACCTCCTCTCTCACAGCATAC |
| GAPDH-F | CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT |
| GAPDH-R | AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC |
采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。
采用miRnada、RNAhybrid和targetscan软件分别预测到10 055种、773种及1 571种不同的miRNA-29a靶基因，通过R软件对三种预测软件获得的靶基因取交集，共得到97个miRNA-29a靶基因，其中包括VEGFA、NFATC1及TSC22D3(图1)。
利用miRNA-29a及U6的特异性引物进行实时荧光定量PCR，检测miRNA-29a的表达量。结果显示，U937巨噬细胞经BCG处理后，miRNA-29a表达显著增加，是未经BCG处理U937巨噬细胞的1.33倍(P<0.05)(图2)。
注：a表示P<0.05；U937巨噬细胞. U937细胞经佛波酯(PMA)诱导分化的巨噬细胞，正常培养23 h；U937巨噬细胞＋BCG. U937巨噬细胞经BCG处理23 h
利用VEGFA、NFATC3、TSC22D3及GAPDH的特异性引物进行实时荧光定量PCR，检测VEGFA、NFATC3和TSC22D3基因的表达情况。结果显示，BCG处理U937巨噬细胞导致VEGFA、NFATC3及TSC22D3的表达均显著增加，分别为正常培养U937巨噬细胞的5.34、99.25和2.12倍(P<0.01)(图3)。
注：b表示P<0.01；U937巨噬细胞. U937细胞经佛波酯(PMA)诱导分化的巨噬细胞，正常培养23 h；U937巨噬细胞＋BCG. U937巨噬细胞经BCG处理23 h
采用miRNA-29a模拟物和miRNA-29a抑制剂分别转染U937巨噬细胞，实时荧光定量PCR检测miRNA-29a表达水平。与未经转染的正常对照组相比，U937巨噬细胞经miRNA-29a模拟物转染后，miRNA-29a显著上调至1.85倍(P<0.01)。U937巨噬细胞经miRNA-29a抑制剂转染后，miRNA-29a显著下调至0.05倍(P<0.01)(图4)。说明miRNA-29a模拟物和miRNA-29a抑制剂转染成功，可用于后续实验。
注：b表示P<0.01；对照. U937细胞经佛波酯(PMA)诱导分化的U937巨噬细胞；miRNA-29a模拟物表示U937巨噬细胞经miRNA-29a模拟物转染；miRNA-29a抑制剂表示U937巨噬细胞经miRNA-29a抑制剂转染
采用实时荧光定量PCR检测VEGFA、NFATC3和TSC22D3基因的表达，与未经转染的正常对照组相比，U937巨噬细胞经miRNA-29a模拟物转染后VEGFA、NFATC3和TSC22D3基因分别上调至1.35、1.29和3.38倍(P<0.05或<0.01)；而U937巨噬细胞经miRNA-29a抑制剂转染后VEGFA、NFATC3和TSC22D3基因分别下调至0.07、0.08和0.55倍(P<0.01)(图5)。
注：a表示P<0.05，b表示P<0.01；对照.佛波酯(PMA)诱导分化的U937巨噬细胞；miRNA-29a模拟物表示U937巨噬细胞经miRNA-29a模拟物转染；miRNA-29a抑制剂表示U937巨噬细胞经miRNA-29a抑制剂转染
结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染性疾病，病死率高。目前，全世界约有三分之一的人口携带处于潜伏感染期的结核分枝杆菌，我国每年新发结核病患者高达数百万人，结核病一直以来都是人类公共卫生健康事业的重大威胁之一[5]。miRNA为长度约20～24个核苷酸的非编码小分子RNA，通过与目标mRNA互补配对，促使mRNA降解或抑制转录后翻译，诱导基因沉默。研究发现，miRNA广泛参与基因表达、细胞发育、信号转导、炎症应答和肿瘤发生等多种生命过程。miRNA也被证实通过调节T细胞相关信号通路，影响先天及后天不同阶段的免疫功能[6]。miRNA在各类受检样本中稳定性高，可被快速准确定量，在多种疾病状态如癌症、糖尿病、心脏疾病及精神疾病中可作为一种非侵袭性的生物标志物来追踪疾病的发生、进展及预后[7]。
在结核病患者中，结核分枝杆菌的感染会影响宿主细胞多种miRNA的表达，从而调控细胞因子表达以及免疫应答反应，miRNA可作为诊断结核分枝杆菌感染及判断抗结核治疗的潜在生物标志物[8,9]。研究显示，miRNA-29a在结核患者血清与痰液中高表达[10]。结核分枝杆菌在体内的宿主细胞为巨噬细胞，本研究发现，BCG菌株感染U937巨噬细胞后，miRNA-29a表达量明显上升，提示miRNA-29a可作为结核分枝杆菌感染的生物标志物。已有的研究发现，miRNA-29a具有多种生物学功能，如miRNA-29a可通过与INF-γ mRNA结合而抑制INF-γ表达，使个体易感性增加[11]；miRNA-29a通过抑制p85α和CDC42蛋白表达，激活p53，引发T细胞凋亡[12,13]；miRNA-29a通过调控STAT3表达，促进单核细胞凋亡[14]；miRNA-29a与Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)相结合，介导巨噬细胞释放白细胞介素(Interleukin，IL)-6以及TNF等细胞因子，激活机体抗微生物防御系统[15]等，提示miRNA-29a可能通过多种机制参与结核病的发生发展。
本研究发现，BCG菌株感染U937巨噬细胞后，VEGFA、NFATC3和TSC22D3基因的表达显著增加。为进一步探究miRNA-29a与VEGFA、NFATC3和TSC22D3基因表达之间的关系，本研究成功构建了过表达和低表达miRNA-29a的U937巨噬细胞系，通过实时荧光定量PCR检测，发现miRNA-29a靶向调控VEGFA、NFATC3和TSC22D3的表达。
VEGFA是血管内皮生长因子(VEGF)家族中的一员，具有促进血管内皮细胞增殖和迁移，刺激新血管形成、增加血管渗透性及促进淋巴管形成等功能[15]。研究发现，肺结核患者痰液和外周血中VEGFA高表达，是活动性结核病的重要生物标志物之一[17,18]。VEGFA在结核病的生理病理过程中发挥重要作用，结核病动物模型研究显示，结核性肉芽肿的形成与VEGFA介导的血管形成密切相关，通过形成新的血管，可促进结核分枝杆菌的生长及播散，而采用抗VEGF抗体进行治疗可有效改善结核病[19,20]。本研究发现，BCG菌株感染后的细胞中VEFGA基因高表达，且VEFGA基因的表达受到miRNA-29a的正向调控，提示在结核分枝杆菌感染过程中，miRNA-29a可能通过上调VEFGA表达，促进结核分枝杆菌感染组织中新生血管的形成，导致病灶结核分枝杆菌的播散以及新的结核性肉芽肿的形成。
NFATC3基因编码活化T细胞核因子3(NFATc3)，是非经典Wnt信号通路中的一员，具有多种生物学功能，在免疫系统的发育和功能发挥中具有重要作用，调控T细胞和未成熟胸腺细胞的相关基因表达及T、B淋巴细胞中促炎细胞因子的表达[21]。此外，NFATc3还调控巨噬细胞中诱生型一氧化氮合成酶(iNOS)的生成，使巨噬细胞发挥杀菌活性[22]；并参与Toll样受体介导的单核/巨噬细胞的固有免疫应答[23]。本研究中，BCG感染U937巨噬细胞后，NFATC3基因高表达，且NFATC3基因的表达受到miRNA-29a的靶向调控，提示miRNA-29a可能通过调控NFATC3表达，调节机体免疫系统，促进T细胞、B细胞和巨噬细胞等免疫细胞对结核分枝杆菌的杀伤作用。
TSC22D3基因编码糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白(GILZ)。GILZ通过抑制NF-κB和丝裂原活化激酶的活化，发挥抗炎症作用，并和免疫抑制密切相关[24]。研究发现，GILZ是调节巨噬细胞内毒素耐受的关键转录因子，动物实验显示GILZ可用于脓毒血症的治疗[25,26]。巨噬细胞是结核分枝杆菌感染人体后主要的寄居场所，也是宿主的抗原提呈细胞，在结核分枝杆菌的感染免疫中发挥重要作用。本研究发现，BCG感染U937巨噬细胞后可导致TSC22D3表达上调，且TSC22D3基因的表达受miRNA-29a调控，提示miRNA-29a可通过调节巨噬细胞TSC22D3表达，调控结核分枝杆菌的感染免疫，发挥对结核分枝杆菌的抗炎作用。
本研究采用U937巨噬细胞系进行了体外研究，尚缺少结核患者数据，下一步我们将收集结核患者样本进行更深入研究，主要包括：检测结核患者血液和支气管肺泡灌洗液中miRNA-29a的表达情况；分离结核患者支气管肺泡灌洗液中的巨噬细胞，测定巨噬细胞功能；检测巨噬细胞中VEGFA、NFATC3及TSC22D3基因的表达情况等。通过体外细胞系和结核患者样本研究，探讨结核疾病中miRNA-29a的表达、调控网络及对结核患者巨噬细胞功能的影响，从而为临床诊断及治疗结核病提供新的思路和方向。
综上所述，结核分枝杆菌感染导致miRNA-29a表达上调，miRNA-29a可作为结核分枝杆菌感染的生物标志物应用于结核病的检测。此外，VEGFA、NFATC3和TSC22D3基因是miRNA-29a调控的靶基因，通过调控这些靶基因的表达，miRNA-29a可能参与结核分枝杆菌的播散和结核性肉芽肿的形成，同时通过影响机体的免疫防御和免疫调节，发挥抗炎、抗感染作用。miRNA-29a在结核病发生发展中的作用复杂多样，其详细分子机制还有待更进一步研究，从而有助于我们更好的认识结核病的分子发病机理，并为结核病的防控和治疗提供有价值的线索。
利益冲突 无
