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HIV进入人体后，机体的免疫系统不能完全清除病毒，长期持续性病毒刺激，导致免疫细胞进行性损伤和异常免疫激活。免疫异常活化是疾病进展的重要因素，与患者预后息息相关[1]。因此，判断HIV感染患者免疫活化状态具有重要的临床意义。有文献报道，慢性HIV感染患者中，HIV抗原可导致T细胞、单核-吞噬细胞和B细胞协同信号增加，诱导产生大量细胞因子，进而导致免疫细胞活化标志物CD38、CD169和B细胞激活因子(BAFF)表达明显上调[2,3,4]。表达CD38的CD8＋ T淋巴细胞其分泌细胞因子功能下降，且细胞增殖能力和细胞毒作用明显受损，与疾病进展相关，是目前评价慢性HIV感染患者免疫活化的主要标志物。CD169为一种黏附分子，其主要功能为识别含有唾液酸的糖链结构，促进细胞间结合，介导细胞间信号转导，参与机体免疫应答[5]。HIV通过包膜糖蛋白120上的唾液酸残基结合单核/吞噬细胞类细胞膜表面的CD169促进HIV在免疫细胞间传染，表达CD169的HIV感染的单核/吞噬细胞与二级淋巴组织内T、B、NK等免疫细胞相互接触，激活T、B、NK等免疫细胞，CD169表达与HIV患者免疫细胞异常激活、HIV在机体内传播和复制相关[6]。BAFF是肿瘤坏死因子超家族配体成员，主要由活化的单核-巨噬细胞、树突样细胞、T淋巴细胞和中性粒细胞等合成和分泌[7]，其主要功能为调控B细胞存活、增殖和抗体产生并参与T淋巴细胞功能调节。HIV感染机体时，淋巴细胞、单核-吞噬细胞及树突样细胞等免疫细胞受病毒刺激而异常活化，导致BAFF分泌增加，BAFF不仅与HIV病毒复制、T淋巴细胞功能相关，还与HIV患者B细胞病理性改变相关[4]。为了综合评价各指标在慢性HIV感染中的应用价值，本研究选取未经抗病毒治疗慢性HIV患者，分析其外周血CD8＋ T淋巴细胞CD38、单核细胞CD169和BAFF水平，现将研究结果报道如下。
收集2017年1月至2017年12月经浙江省疾病预防控制中心确诊、在册资料齐全的门诊未进行抗病毒治疗的慢性HIV感染患者50例，其中男性40例，女性10例，年龄为(37.4±14.9)岁。纳入标准[8]：HIV抗体确认阳性且发现时间>12个月。排除标准：急性期HIV感染患者；存在严重合并症、机会感染、结核、梅毒和病毒性肝炎的患者。根据CD4＋ T淋巴细胞数量，将慢性HIV感染患者分为<200个/μL即艾滋病期组(n＝27)和≥200个/μL即无症状期组(n＝23)。同时选取30名健康体检者为对照组，其中男性22例，女性8例，年龄(36.8±13.6)岁。所有患者及健康体检者均签署知情同意书，本研究获得医院伦理委员会的审核和批准(批号：201701019)。
FACS CantoⅡ流式细胞分析仪及原装CD3、CD4、CD8、CD14、CD16、CD169试剂(美国BD公司); Sysmex-2100全自动血细胞分析仪及原装配套试剂(日本Sysmex公司)；美国ABI 7500实时荧光定量PCR仪及达安基因HIV-1核酸测定试剂盒，Andy gene公司人BAFF酶联免疫分析定量试剂盒。仪器均定期用配套校准物校准并用质控品进行质量控制。
采集慢性HIV感染患者和健康体检者静脉血5 mL，其中EDTA-K2抗凝2 mL，2 h内完成上机检测分析，肝素抗凝血3 mL离心收集血浆，－80℃保存。
取EDTA-K2抗凝2 mL，混匀上Sysmex-2100全自动血细胞分析仪检测，记录外周血淋巴细胞和单核细胞绝对值。
取所有对象外周血100 μL加入目标荧光标记抗体各10 μL，室温混匀标记20 min，加入溶血素破坏红细胞10 min，300×g离心5 min弃上清液沥干，再用缓冲液2 mL洗涤1次，200×g离心5 min弃上清液沥干，再加入缓冲液200 μL，混匀上机进行分析。记录CD4＋ T淋巴细胞、CD8＋ CD38＋ T淋巴细胞和CD169＋ CD14＋细胞比例，乘以外周血淋巴细胞绝对值和单核细胞绝对值获得CD4＋ T淋巴细胞、CD8＋CD38＋细胞和CD169＋CD14＋细胞绝对值。
将待测样本与阴性质控品、HIV-1强阳性、HIV-1临界阳性质控品按照试剂说明书进行核酸提取，取PCR反应管将各组试剂组分充分混合，混合好后进行短时离心至管底，之后将30 μL扩增体系分装到PCR管中，在上述HIV-1反应管中加入已提取的核酸20 μL，盖紧管盖，4 672×g离心数秒移至扩增检测区，放于ABI 7500实时荧光定量PCR仪设置反应参数进行检测，自动获取分析结果，记录结果。
－80℃保存血浆快速解冻后混匀待检，在酶包被板上加入浓度为3 000、2 000、1 000、500、250 ng/L标准品用于制作标准曲线，并设立空白对照；先在酶包被板上各个测试孔中加入样品稀释液40 μL，再加入标本10 μL，混匀，封板37℃水浴30 min，后甩干液体，用事先配好的洗涤液，洗板3次并拍干，随后每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外；封板37℃水浴30 min，后甩干液体，用事先配好的洗涤液，洗板3次并拍干；分别加入显色剂A和B各50 μL混匀，避光15 min，再加入终止液50 μL终止反应，以空白调零，450 nm波长测量各孔吸光度值，参照标准曲线得出各个标本的BAFF浓度。
采用SPSS 19.0统计软件分析。定性数据使用χ2检验，正态分布的数据以
±s表示，多组间均数比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验；两组间相关性应用Pearson相关进行分析；诊断效率用受试者工作特征(ROC)曲线分析，诊断效率运用Z检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
艾滋病期组、无症状期组和健康对照组三组性别构成和年龄分布相比，差异均无统计学意义(P值均>0.05)。慢性HIV感染患者艾滋病期组、无症状期组两组感染时间无统计学意义(t＝1.03，P>0.05)，病毒载量具有统计学意义(t＝5.30，P<0.05)，见表1。
不同CD4＋T淋巴细胞水平慢性HIV感染患者一般资料比较(
±s)
不同CD4＋T淋巴细胞水平慢性HIV感染患者一般资料比较(±s)
| 组别 | 例数 | 性别(例，男/女) | 年龄 | 感染时间(年) | 病毒载量(lg拷贝/mL) |
|---|---|---|---|---|---|
| 艾滋病期组 | 27 | 21/6 | 39.6±17.4 | 4.5±1.3 | 4.55±0.60 |
| 无症状期组 | 23 | 19/4 | 35.3±11.3 | 4.0±1.8 | 3.72±0.49 |
| 健康对照组 | 30 | 22/8 | 36.8±13.6 | － | － |
| F/t值 | － | 0.64 | 0.75 | 1.03 | 5.30 |
| P值 | － | >0.05 | >0.05 | >0.05 | <0.05 |
注："－".无相关数据
三组CD38＋ CD8＋ T淋巴细胞计数和比例比较，差异均具有统计学意义(F＝4.45和18.95，P<0.05)。其中，艾滋病期组和无症状期组的CD38＋ CD8＋ T淋巴细胞计数和比例均明显高于健康对照组(P<0.05)，艾滋病期组和无症状期组CD38＋ CD8＋ T淋巴细胞计数和比例比较，差异均无统计学意义(P值均>0.05)。三组CD169＋单核细胞计数和比例比较，差异具有统计学意义(F＝16.62和35.27，P<0.05)。艾滋病期组和无症状期组的CD169＋单核细胞计数和比例均明显高于健康对照组(P值均<0.05)，艾滋病期组和无症状期组CD169＋单核细胞计数比较，差异无统计学意义(P >0.05)，而艾滋病期组的CD169＋单核细胞比例明显高于无症状期组(P<0.05)。三组BAFF水平比较，差异具有统计学意义(F＝55.47，P<0.05)。艾滋病期组和无症状期组的BAFF水平均明显高于健康对照组(P值均<0.05)，艾滋病期组的BAFF水平明显高于无症状期组(P<0.05)，见表2。
不同CD4＋T淋巴细胞水平慢性HIV感染患者各指标的比较(
±s)
不同CD4＋T淋巴细胞水平慢性HIV感染患者各指标的比较(±s)
| 组别 | 例数 | CD38＋CD8＋T淋巴细胞 | CD169＋单核细胞 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 计数(个/μL) | 比例(%) | 计数(个/μL) | 比例(%) | BAFF(ng/L) | ||
| 艾滋病期 | 27 | 413.6±218.8 | 64.0±17.9 | 256.7±98.4 | 70.0±16.4 | 1737.5±719.7 |
| 无症状期 | 23 | 483.1±228.3 | 54.9±16.0 | 177.3±90.3 | 50.0±19.1 | 922.5±313.1 |
| 健康对照组 | 30 | 167.2± 62.8 | 14.6± 5.3 | 11.8± 3.3 | 2.6± 0.8 | 456.9±163.7 |
| F值 | － | 4.45 | 18.95 | 16.62 | 35.27 | 55.47 |
| P值 | － | <0.05 | <0.05 | <0.05 | <0.05 | <0.05 |
注："－".无相关数据；BAFF. B细胞激活因子
慢性HIV感染患者CD38＋CD8＋T淋巴细胞、CD169＋单核细胞比例和BAFF浓度与CD4＋ T淋巴细胞均呈负相关(r＝－0.567、－0.706和－0.56，P值均<0.05)，而与HIV病毒载量均呈正相关(r＝0.315、0.392和0.607，P值均<0.05)。
将艾滋病期组设为正类，无症状期组设为负类，建立ROC曲线分析CD38＋ CD8＋ T淋巴细胞、CD169＋单核细胞比例和BAFF水平诊断艾滋病期的效能。结果显示，CD38＋ CD8＋ T淋巴细胞比值曲线下面积(AUC)为0.668(95%CI 0.518～0.818)，约登指数为0.306；CD169＋单核细胞比例AUC为0.795(95% CI 0.668～0.921)，约登指数为0.541；BAFF水平AUC为0.881(95% CI 0.790～0.972)，约登指数为0.611。三种指标均可用于判断艾滋病期(P<0.05或<0.01)。曲线下面积间比较，三种指标之间均无统计学意义(P值均>0.05)，见图1和表3。
各指标在慢性HIV感染患者艾滋病期的分期价值
各指标在慢性HIV感染患者艾滋病期的分期价值
| 指标 | 曲线下面积 | P值 | 95%置信区间 | 临界值 | 敏感度(%) | 特异度(%) | 约登指数 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CD38＋CD8＋T淋巴细胞(%) | 0.668 | <0.05 | 0.518～0.818 | 52.75 | 74.1 | 56.5 | 0.306 |
| CD169＋单核细胞(%) | 0.795 | <0.01 | 0.668～0.921 | 59.5 | 88.9 | 65.2 | 0.541 |
| BAFF(ng/L) | 0.881 | <0.01 | 0.790～0.972 | 1 281.5 | 74.1 | 87.0 | 0.611 |
注：BAFF.B细胞激活因子
慢性HIV感染患者由于长期持续性病毒复制，HIV抗原水平不断增高，更多的免疫细胞被激活，导致机体免疫功能进一步受损，抗病毒能力下降，同时激活的免疫细胞又为病毒复制提供更多的宿主细胞，有利于病毒传播和复制，两者相辅相成，相互促进。因此，免疫细胞活化状态与病毒载量、机体免疫功能和疾病进展高度相关[9,10]。
慢性HIV感染从病程上分为无症状期和艾滋病期。其中无症状期持续时间较长且个体差异较大，时间跨度长短不一。艾滋病期是HIV的最终阶段，易发各种机会感染和肿瘤，CD4＋ T细胞<200个/μL是目前判断艾滋病期的主要标准[8]。本研究根据CD4＋ T细胞计数将门诊未抗病毒治疗的慢性HIV感染患者分为艾滋病期组和无症状期组，并对两组的各个指标进行分析。结果显示，艾滋病期组患者的CD38＋CD8＋ T淋巴细胞的数量和比例较无症状期升高，但差异均无统计学意义，这可能与感染初期CD8＋ T的激活水平快速增高，CD4＋ T细胞计数减少相关，随着感染时间的延长，CD8＋ T的激活水平增幅减小，CD4＋ T细胞计数却加速减少，导致两者相关性降低。艾滋病期组CD169＋单核细胞数量较无症状期增加，但差异无显著性，这可能与CD169＋单核细胞数量是由CD169＋单核细胞比例乘外周血单核细胞绝对值获得，而两组外周血单核细胞绝对值间无显著性差异有关。CD169＋单核细胞比例和BAFF显著升高，差异具有统计学意义，其中尤以BAFF差异更为明显，与Carbone等[11]报道的低CD4＋ T细胞水平时BAFF分泌明显增加相一致，这可能与艾滋病期患者免疫细胞活化程度增高及B细胞的病理性改变加剧有关。CD4＋ T细胞计数和病毒载量是目前判断疾病进展、疗效和预后的主要指标[8]。本研究对免疫活化状态指标CD38＋CD8＋ T淋巴细胞、CD169＋单核细胞及BAFF水平与病毒载量、CD4＋ T细胞数量进行了相关性研究，以评估上述免疫活化指标在HIV疾病进展中的价值。结果表明，HIV慢性感染患者各指标同HIV病毒载量呈显著正相关，各指标同CD4＋ T细胞呈显著负相关。以上结果表明，CD8＋ T淋巴细胞CD38和单核细胞CD169及BAFF表达水平与HIV疾病进展相关。
为了进一步探讨本研究中各指标在慢性HIV感染疾病分期中的价值，进行了ROC曲线分析。结果显示，3个指标均有助于艾滋病期的判断，但3个指标间均无统计学意义。CD38＋CD8＋ T淋巴细胞和CD169＋单核细胞比例分别取52.75%和59.5%为最佳诊断界值，两者均具有一定的敏感度，但特异度均较差；BAFF的最佳诊断界值为1 281.5 ng/L，具有较好的灵敏度和特异度，同时3个指标的约登指数显示，BAFF的约登指数数值最大，表明BAFF与临床符合率最高，这可能与BAFF异常升高引起调控B细胞存活、增殖和生成抗体功能紊乱，导致HIV中和抗体生成减少、B细胞正向调控CD4＋T淋巴细胞作用减弱，加速CD4＋ T细胞减少，与疾病进展有关[12] 。
综上所述，慢性HIV感染患者免疫活化指标CD38＋CD8＋ T淋巴细胞、CD169＋单核细胞比例和BAFF明显升高，与CD4＋ T细胞数量和病毒载量相关，CD169＋单核细胞比例和BAFF指标艾滋病期较无症状期均明显增高，可作为潜在预测疾病进展的辅助指标。
利益冲突 无
