分析慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者核苷(酸)类药物(NAs)HBV逆转录酶区相关耐药突变位点的异质性，为规范抗病毒治疗和耐药管理提供参考价值。
收集2011年4月至2018年3月宁波市第二医院及宁波市第四医院慢性HBV感染者NAs治疗发生病毒学突破或应答不佳2 765例的血液标本，采用实时荧光定量PCR方法对血清HBV多聚酶区进行扩增，对PCR产物进行直接测序并分析测序结果。根据用药情况分为拉米夫定(LAM)单药耐药组(n＝603)、替比夫定(LdT)单药耐药组(n＝147)、阿德福韦酯(ADV)单药耐药组(n＝68)、恩替卡韦(ETV)单药耐药组(n＝10)和NAs序贯或联合耐药组(n＝365)，分析各组耐药突变位点及耐药模式(通路)。采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析。
在2 765例慢性HBV感染者的血液标本中，检测出NAs相关HBV-RT区耐药突变1 193例，总突变率为43.15%。LAM单药耐药组的突变率为62.62%(603/963)，共19种突变类型，以单位点突变rtM204I/V最多见(40.30%，243/603)。LdT单药耐药组的突变率为45.51%(147/323)，共3种突变类型，以单位点突变rtM204I/V最多见(59.86%，88/147)。ADV单药耐药组的突变率为17.80%(68/382)，主要为rtA181T单点突变(64.71%，44/68)。ETV单药耐药组的突变率为4.06%(10/246)，以rtT184A/G/S/I/L/F单点突变最多见(80.00%，8/10)。序贯或联合治疗耐药组的突变率为41.91%(365/871)，其中LAM/LdT应答不佳或耐药序贯ADV组突变率为63.39%(142/224)，以rtA181V/T最多见(35.21%，50/142)；LAM/LdT应答不佳或耐药联合ADV组突变率为42.19%(54/128)，以rtA181V/T最多见(46.30%，25/54)；LAM/LdT应答不佳或耐药后序贯ETV 1.0 mg组突变率为44.66%(117/262)，以rtL180M＋M204I/V＋S202G/I最多见(31.62%，37/117)；LAM/LdT应答不佳或耐药ETV联合ADV组突变率为7.14%(5/70)，均为多位点突变；ADV应答不佳或耐药序贯ETV 0.5 mg组突变率为28.14%(47/167)，均为多位点突变。rtV173L、rtL180M、rtV214A等次要(补偿)位点及rtV207I/L/G、rtS213T、rtN238T等尚未完全明确位点的单位点突变均被检测出。NAs单药治疗的耐药模式(通路)较为单一，NAs经治患者(序贯或联合治疗组)的耐药模式(通路)复杂多样，存在多个耐药模式(通路)，并随着NAs种类的增加而增加。非一线NAs相关耐药模式(通路)的构成比基本呈总体下降趋势，而ETV相关耐药的构成比基本呈总体上升趋势。
NAs相关HBV耐药突变位点(模式)复杂多样，特别是多位点突变、难治性耐药突变、多药耐药突变和交叉耐药突变。因此，优选、优化抗病毒治疗策略和耐药管理观念需不断更新。
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当前，我国慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染在很长时间内仍属重大公共卫生问题[1]。慢性HBV感染者如果病情反复活动或者持续进展，则需要及时给予抗病毒治疗[2,3,4,5,6]。核苷(酸)类似物(NAs)是临床上应用最广泛的抗病毒药物，包括恩替卡韦(ETV)、替诺福韦酯(TDF)、拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)和阿德福韦酯(ADV)。与NAs相关的耐药突变均位于HBV基因组P区的逆转录酶区(RT区)。随着NAs的广泛、长期和不规范应用，由NAs引发的耐药突变不断增多[7,8,9,10,11]，已成为制约HBV相关肝脏疾病防治的重要因素和严重的公共卫生问题[7,12]。因此，HBV的耐药管理亟待加强。本研究旨在通过分析NAs相关HBV-RT区耐药突变模式的异质性，为指导规范抗病毒治疗提供参考价值。
收集宁波市第二医院及宁波市第四医院2011年4月至2018年3月就诊慢性HBV感染者NAs治疗且发生病毒学突破或应答不佳2 765例的血液标本(HBV DNA≥103 IU/mL)，共检测出NAs相关HBV-RT区耐药突变1 193例。其中男性878例，女性315例；年龄17～79岁，中位年龄43岁。根据NAs种类的不同分为LAM单药耐药组(n＝603)、LdT单药耐药组(n＝147)、ADV单药耐药组(n＝68)、ETV单药耐药组(n＝10)和NAs序贯或联合耐药组(n＝365)。本研究经医院伦理委员会批准通过(批件号：PJ-NBEY-KY-2017-069-01)，且所有患者均签署知情同意书。
慢性HBV感染者符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》的标准[2]。应答不佳是指依从性良好的患者，治疗24周时HBV DNA较基线下降幅度>1 lg IU/mL，但仍可检测到[2]；基因型耐药是指在抗病毒治疗过程中，检测到与HBV耐药相关的位点突变；交叉耐药是指针对一种抗病毒药物出现的耐药突变对另外一种或几种抗病毒药物也出现耐药；多药耐药是指至少对两种不同类别的NAs耐药。耐药模式(通路)包括L型核苷耐药模式(通路)、无环磷酸盐耐药模式(通路)、共享(公共)耐药模式(通路)、双重耐药模式(通路)和ETV初治耐药模式(通路)[7]。
NAs耐药基因测序采用ABI 3130型基因测序仪，检测过程包括定量PCR扩增、PCR产物的酶解及测序PCR反应，试剂盒为上海申友生物技术有限责任公司生产，严格按照试剂盒的说明操作。检测的位点包括NAs相关主要耐药突变位点、次要(补偿)位点及一些尚未完全明确位点(表1)。
核苷(酸)类似物相关耐药突变位点
核苷(酸)类似物相关耐药突变位点
| 药物 | 主要位点 | 次要(补偿)位点[13] | 尚未完全明确位点 |
|---|---|---|---|
| LAM | rt M204I/V、A181V/T | V173L、L180M | V207I/L/G、S213T |
| LdT | rt M204I/V | L180M | － |
| ADV | rt N236T、A181V/T | V214A、Q215S、I233V | P237H、N238T |
| ETV | rt T184A/G/S/I/L/F、S202G/I、M250V/L/I | I169T、L180M、M204I/V | － |
注："－".无相关数据；LAM.拉米夫定；LdT.替比夫定；ADV.阿德福韦酯；ETV.恩替卡韦；rt.逆转录酶区
采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析。计数资料采用例(百分数)表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
在2 765例慢性HBV感染者的血液标本中，检测出NAs相关HBV-RT区耐药突变1 193例，总突变率为43.15%。LAM单药耐药组用药时间1.3～6.1年，中位时间3.6年，突变率为62.62%(603/963)，共19种突变类型：单位点突变322例(53.40%)，共5种突变类型，以rtM204I/V最多见(40.30%，243/603)，rtV173L、rtL180M等次要(补偿)位点及rtV207I/L/G、rtS213T等尚未完全明确位点的单位点突变均被检测出；多位点突变281例(46.60%)，共14种突变类型，以rtLl80M＋rtM204V最多见(30.68%，185/603)，≥3个位点突变62例，占多位点突变的22.06%。LdT单药耐药组用药时间2.5～5.6年，中位时间3.8年，突变率为45.51%(147/323)，共3种突变类型。以rtM204I/V(59.86%，88/147)和rtLl80M＋rtM204V多见(38.01%，56/147)。ADV单药耐药组用药时间3.7～7.5年，中位时间5.4年，突变率为17.80%(68/382)，主要为rtA181T单点突变(64.71%，44/68)。ETV单药耐药组用药时间4.8～12.2年，中位时间8.6年，突变率为4.06%(10/246)，以rtT184A/G/S/I/L/F单点突变最多见(80.00%，8/10)。NAs序贯或联合治疗耐药组的突变率为41.91%(365/871)，其中LAM/LdT应答不佳或耐药序贯ADV组ADV用药时间2.1～4.8年，中位时间3.2年，突变率63.39%(142/224)，以rtA181V/T最多见(35.21%，50/142)，rt 181V/T＋N236T位居第二位(16.90%，24/142),多位点突变占54.23%(77/142)；LAM/LdT应答不佳或耐药联合ADV组联合用药时间4.6～8.6年，中位时间5.7年，突变率为42.19%(54/128)，以rtA181V/T最多见(46.30%，25/54)，rt N236T位居第二位(18.52%，10/54)，多位点突变占35.19%(19/54)；LAM/LdT应答不佳或耐药后序贯ETV 1.0 mg组ETV用药时间2.8～5.3年，中位时间3.7年，突变率为44.66%(117/262)，以rtL180M＋M204I/V＋S202G/I最多见(31.62%，37/117)，rtL180M＋M204I/V＋T184A/G/S/I/L/F位居第二位(21.37%，25/117)，多位点突变占94.92%(112/118)；LAM/LdT应答不佳或耐药ETV联合ADV组联合用药时间4.2～7.9年，中位时间6.3年，突变率为7.14%(5/70)，均为多位点突变；ADV应答不佳或耐药序贯ETV 0.5 mg组ETV用药时间4.9～9.2年，中位时间6.6年，突变率28.14%为(47/167)，以rtL180M＋M204I/V＋S202G/I最多见(40.42%，19/47)，rtL180M＋M204I/V＋T184A/G/S/I/L/F位居第二位(23.40%，11/47)，均为多位点突变。见表2。
核苷(酸)类似物不同治疗方案各组变异模式
核苷(酸)类似物不同治疗方案各组变异模式
| 耐药模式 | 例数(n) | 构成比(%) | |
|---|---|---|---|
| LAM单药耐药组 | 603 | 100.00 | |
| rt M204I/V | 243 | 40.30 | |
| rt L180M＋M204I/V | 185 | 30.68 | |
| rt S213T | 38 | 6.30 | |
| 其他 | 137 | 22.72 | |
| LdT单药耐药组 | 147 | 100.00 | |
| rt M204I/V | 88 | 59.86 | |
| rt L180M＋M204I/V | 56 | 38.01 | |
| rt L180M | 3 | 2.04 | |
| ADV单药耐药组 | 68 | 100.00 | |
| rt A181V/T | 44 | 64.71 | |
| rt N236T | 9 | 13.24 | |
| rt A181V/T＋N236T | 7 | 10.29 | |
| 其他 | 8 | 11.76 | |
| ETV单药耐药组 | 10 | 100.00 | |
| rt T184A/G/S/I/L/F | 8 | 80.00 | |
| rt M250V/L/I | 1 | 10.00 | |
| rt I169T＋M204I | 1 | 10.00 | |
| 序贯或联合治疗耐药组 | 365 | ||
| LAM/LdT应答不佳或耐药序贯ADV | 142 | 100.00 | |
| rt A181V/T | 50 | 35.21 | |
| rt A181V/T＋N236T | 24 | 16.90 | |
| rt M204I/V＋A181V/T | 18 | 12.68 | |
| 其他 | 50 | 35.21 | |
| LAM/LdT应答不佳或耐药联合ADV | 54 | 100.00 | |
| rt A181V/T | 25 | 46.30 | |
| rt N236T | 10 | 18.52 | |
| rt A181V/T＋N236T | 6 | 11.11 | |
| 其他 | 13 | 24.07 | |
| LAM/LdT应答不佳或耐药序贯ETV 1.0 mg | 117 | 100.00 | |
| rt L180M＋M204I/V＋S202G/I | 37 | 31.62 | |
| rt L180M＋M204I/V＋T184A/G/S/I/L/F | 25 | 21.37 | |
| rt L180M＋M204I/V＋T184A/G/S/I/L/F＋S202G/I | 11 | 9.41 | |
| 其他 | 44 | 37.60 | |
| LAM/LdT应答不佳或耐药ETV联合ADV | 5 | 100.00 | |
| rtL180ML＋M204I/V＋A181V/T＋T184A/G/S/I/L/F | 1 | 20.00 | |
| rt L180M＋M204I/V＋A181V/T＋S202G/I | 1 | 20.00 | |
| rt L180M＋M204I/V＋A181V/T＋M250V/L/I | 1 | 20.00 | |
| rt L180M＋A181V/T＋N236T＋M250V/L/I | 1 | 20.00 | |
| rt M204I/V＋A181V/T＋V214A＋T184A/G/S/I/L/F | 1 | 20.00 | |
| ADV应答不佳或耐药序贯ETV 0.5 mg | 47 | 100.00 | |
| rt L180M＋M204I/V＋S202G/I | 19 | 40.42 | |
| rt L180M＋M204I/V＋T184A/G/S/I/L/F | 11 | 23.41 | |
| rt M204I/V＋A181V/T＋T184A/G/S/I/L/F | 5 | 10.64 | |
| 其他 | 11 | 25.53 | |
注：LAM.拉米夫定；LdT.替比夫定；ADV.阿德福韦酯；ETV.恩替卡韦
NAs单药治疗的耐药模式(通路)较为单一。LAM单药耐药组含L型核苷耐药模式(通路)突变515例，占85.41%(515/603)；LdT单药耐药组含L型核苷耐药模式(通路)突变144例，占97.96%(144/147)；ADV单药耐药组含共享(公共)耐药模式(通路)突变45例，占66.18%(45/68)，含无环磷酸盐耐药模式(通路)突变9例，占13.24%(9/68)，含双重耐药模式(通路)突变7例，占10.29%(7/68)；其余均为尚未明确的耐药模式(通路)。ETV单药耐药组仅存在与其相关的单位点突变，未发现ETV初治耐药模式(通路)。NAs经治患者(序贯或联合治疗组)的耐药模式(通路)复杂多样，存在多个耐药模式(通路)；耐药模式(通路)随着NAs种类的增加而增加，LAM/LdT应答不佳或耐药ETV联合ADV组存在3个耐药模式(通路)，ADV应答不佳或耐药序贯ETV 0.5 mg组亦存在3个耐药模式(通路)，即L型核苷耐药模式(通路)＋共享(公共)耐药模式(通路)/双重耐药模式(通路)＋ETV初治耐药模式(通路)。
耐药模式(通路)的时间分布显示，L型核苷耐药模式(通路)和无环磷酸盐耐药模式(通路)的构成比虽然上下波动，但总体呈下降趋势，共享(公共)耐药模式(通路)和双重耐药模式(通路)的构成比2017年以后略有上升，但总体亦呈下降趋势，而ETV初治耐药模式(通路)的构成比虽然2015年度有所下降，但总体呈上升趋势。具体分布见图1。
HBV基因组特殊的结构特点及其生活周期特点，以及NAs的广泛应用，决定了HBV突变率较高且复杂。突变可改变病毒的生物学行为，使得病毒的致病性发生改变，影响疾病的进展，也可改变对抗病毒药物的敏感性，影响治疗效果。病毒的突变与临床的关系一直是研究的重要方向[14]。
随着NAs的广泛应用和不规范应用(包括单药随意序贯、短期内频繁换药或加药，以及耐药后不合理加药或换药等)，加之患者的依从性较差[7]，HBV的耐药突变呈现逐年增多趋势，尤其是难治性耐药突变、多药耐药突变和交叉耐药突变[9,10]。本研究结果显示，NAs相关HBV-RT区总突变率为43.15%(1 193/2 765)，低于柳朔怡等[15]的研究结果(1 202/2 223，54.07%)，显著高于Zhang等[16]的研究结果(1 248/4 055，30.8%)。究其原因，可能与初治应用NAs的种类(LAM、LdT及ADV为二线药物，低耐药基因屏障；ETV为一线药物，高耐药基因屏障)、患者的用药史(经治患者的构成)、用药持续时间和患者用药时的疾病状态等因素相关。我们也将开展进一步研究，分析患者的用药情况及其临床特征。
本研究中，耐药突变位点(模式)复杂多样，有75种突变模式，尤其是多位点突变模式(64种)和ETV相关耐药突变模式(NAs经治应答不佳或耐药患者ETV序贯或联合治疗)。全部为主要耐药位点突变的例数仅占总突变例数的48.03%，单位点突变仅占49.29%；多数为含次要(补偿)位点与尚未完全明确位点，以及多位点突变。因此，我国大部分患者都面临着抗病毒治疗应答不佳和(或)高耐药发生的风险[1]。与此同时，次要(补偿)耐药突变位点与尚未完全明确耐药突变位点的研究报道不断增多，除了已明确的5条耐药模式(通路)外，是否存在其他的耐药通路？这些变异株达到病毒群的多少百分比可以称为优势株？优势株占多少比例时会出现病毒学突破等有待进一步的研究。
本研究还发现，rtV173L、rtL180M及rtV214A等次要(补偿)位点的单位点突变均被检测出。一般来说，LAM耐药突变在rtM204I/V出现后，若继续维持LAM治疗，则会出现耐药性更强的rtL180M突变，并进一步引发rtV173L突变[13]。因此，理论上与LAM耐药相关的耐药模式应该是rtM204I/V、rtL180M＋M204I/V和rtV173L＋L180M＋M204I/V。rtN236T是ADV标志性耐药变异位点，继续ADV治疗，引起YMDD临近区域的rtAl8lV/T耐药变异[13]。rtV214A为与ADV耐药相关的突变位点，可单独出现，并与LAM出现交叉耐药。另外，与ETV相关的rtT184A/G/S/I/L/F及rtM250V/L/I单位点突变也被检测出。理论上，ETV的耐药位点是在LAM耐药位点(rtL180M＋M204I/V)基础上同时出现rtI169T、rtT184A/G/S/I/L/F、rtS202G/I及rtM250V/L/I任意一个或多个位点突变，3个位点同时发生才可导致耐药[7]；与ETV相关的耐药模式均为多位点突变。而这些补偿位点、ETV耐药相关的单位点突变株被检测出，是否可以成为优势株？其临床意义如何？需要后续的研究结合HBV基因型、全基因序列及患者的临床特征等反复验证。
一般来说，NAs单药治疗所诱导的耐药模式(通路)较为单一。而对于NAs经治患者出现应答不佳或耐药后，无论采用何种序贯治疗方案，其后续的耐药突变率均显著升高；即便是NAs联合治疗方案，其后续的耐药突变率也相对较高；而且耐药模式(通路)随着NAs种类的增加而增加，如LAM/LdT应答不佳或耐药后序贯ETV 1.0 mg组多位点、多耐药模式(通路)突变占94.92%，LAM/LdT应答不佳或耐药ETV联合ADV组均为多位点、多耐药模式(通路)突变。基于无病毒复制则无耐药突变的原理，因此，初治优选用药和应答不佳出现后及时优化(联合)用药显得极为重要[1]。
在我国，非一线抗病毒药物(LAM、LdT和ADV)仍较广泛使用，因此，与其相关的L型核苷耐药模式(通路)、无环磷酸盐耐药模式(通路)、共享(公共)耐药模式(通路)及双重耐药模式(通路)的例数仍占多数。但随着一线抗病毒药物(ETV、TDF)的便捷获取(治疗理念的接受和药费的降低等)[2,17]，初治患者已较少使用非一线抗病毒药物，因此上述单个耐药模式的构成总体上逐渐下降；但与此同时，非一线抗病毒药物经治患者序贯或联合ETV的例数也在增多，导致ETV耐药模式(通路)的例数总体上逐渐上升，而且3个以上位点突变或耐药模式(通路)突变(交叉耐药和多药耐药)的例数也在增多，需要引起重视。
目前我国NAs相关耐药率较高，耐药模式的多样性，难治性耐药、多药耐药和交叉耐药的复杂性，给慢性HBV感染相关疾病的防治造成很大的制约。随着对NAs耐药机制研究的不断深入，优选、优化抗病毒治疗策略和耐药管理的观念也需不断更新，方可实现慢性HBV感染者的持续获益。
利益冲突 无
