探究牛型结核分枝杆菌减毒活菌-卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin vaccine，BCG)感染人树突细胞(Dendritic cells，DCs)对新生儿脐血CD4＋初始T淋巴细胞分化的作用。
使用BCG感染体外培养的人DCs，然后与新生儿脐血CD4＋初始T淋巴细胞共培养，采用qRT-PCR检测DCs中的miRNA-99b表达水平及CD4＋T淋巴细胞中的Foxp3、ROR-γt、IFN-γ及IL-10基因转录水平。利用miRNA-99b反义寡核苷酸转染DCs，与新生儿脐血CD4＋初始T淋巴细胞共培养后，再次检测CD4＋T淋巴细胞相关基因转录水平。采用SPSS 15.0对数据进行分析。
BCG感染的DCs中miRNA-99b基因转录水平明显高于未感染BCG的DCs中的转录水平(t＝7.06，P<0.05)。与感染BCG的DCs共培养的CD4＋T淋巴细胞中的IFN-γ基因[(45.61±4.46)比(3.54±1.73)，t＝32.32，P<0.01]、IL-10基因[(4.17±1.06)比(1.26±0.67)，t＝2.24，P<0.05]转录水平明显高于与未感染BCG的DCs共培养的CD4＋T淋巴细胞，而ROR-γt基因转录水平低于与未感染BCG的DCs共培养的CD4＋T淋巴细胞[(0.08±0.02)比(0.63±0.10)，t＝0.42，P<0.01]。与转染NC-siRNA的DCs共培养的CD4＋初始T细胞相比，阻断DCs中miRNA-99b的表达后，共培养的CD4＋初始T淋巴细胞Foxp3基因[(0.12±0.01)比(1.57±0.90)，t＝1.06，P<0.05]、IFN-γ基因[(0.03±0.01)比(0.64±0.35)，t＝0.44，P<0.05]、IL-10基因[(0.03±0.01)比(0.76±0.09)，t＝0.54，P<0.01]表达均降低，ROR-γt基因表达增加[(17.03±5.51)比(1.32±0.14)，t＝11.54，P<0.01]。
BCG通过调控DCs中miRNA-99b的表达进而诱导初始CD4＋T淋巴细胞分化为Th17/Treg的失衡，导致感染的发生、发展。
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结核分枝杆菌可能通过抑制树突细胞(Dendritic cells，DCs)等抗原递呈细胞的功能从而干扰抗结核固有免疫应答向适应性免疫应答及时有效的转换，而得以在宿主吞噬细胞中存活及繁殖[1]。研究发现，微小RNA(miRNAs)可能参与这一免疫调节过程[2]。基于小鼠结核感染模型的研究发现，在结核分枝杆菌标准菌株H37Rv感染的DCs和巨噬细胞中miRNA-99b转录水平显著升高，而以反义寡核苷酸阻断其表达后，DCs内结核分枝杆菌的生长明显受到抑制[3]。临床研究发现，结核病患者无论是外周血还是胸腔积液中均可发现Th17/Treg表达失衡，但具体机制鲜见报道[4]。该研究构建了人DCs体外卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin vaccine，BCG)感染模型，同时与新生儿脐血混合培养研究BCG感染对人DCs内miRNA-99b表达的影响及对人CD4＋初始T淋巴细胞分化的作用，旨在探讨结核分枝杆菌感染机体后固有免疫向适应性免疫的转换过程及可能的机制，为深入探讨结核分枝杆菌感染宿主的相关机制提供线索。
人皮内注射用BCG 0.25 mg/支(201601030102)购自上海生物制品研究所；培养液RPMI 1640(SH30809.01B)及胎牛血清(16000-044)均购自Hyclone公司；Real-time PCR试剂盒(AQ131-01)、Trizol液(H10318)及RNA溶解液(H10323)均购自全式金公司；抗-CD4 FITC(兔抗人，11-0048-41)及抗-CD11c PE(兔抗人，12-0116-41)均购自Ebio公司；人IL-23 ELISA试剂盒(EHC171)、人IL-17 ELISA试剂盒(EHC170)及人IFN-γ ELISA试剂盒(EHC102g)均购自欣博盛公司；rhGM-CSF(149-11-1)购自上海江莱生物；实验中所用引物均购自上海生工。CO2细胞培养箱为Thermo Scientific(SW-CJ-1FD)；无菌操作台为苏州净化(SW-CJ-1FD)；低速离心机为上海卢湘仪(5702R)；PCR仪为Eppendorf(533353658)；实时荧光定量PCR仪为Eppendorf(X226488N)；倒置拍照显微镜为Leica(IX51)；流式细胞仪为BD(Accuri C6)。
取健康志愿者外周抗凝血10 mL转入50 mL离心管中，加入10 mL PBS溶液稀释，轻轻混匀。取两支15 mL离心管，先加入5 mL Ficoll溶液。然后取10 mL稀释的血液轻轻加到两支离心管的Ficoll上层，动作轻柔，避免两种溶液混合在一起，200×g，离心20 min，降速设置中设置成no break，或只有1～2成的制动。外周血单个核细胞(PBMC)所在细胞层为白色。用吸管将该层细胞吸取置于另一干净的15 mL离心管中，加入PBS至10～15 mL，150×g，离心10 min后去掉上清液，再加入培养基(1640培养液＋10% FBS＋1% P/S)进行相同操作的清洗；加入5～10 mL培养基重悬细胞，即获得人PBMC。使用无血清的RPMI 1640培养基洗去悬浮细胞，用PBS再清洗两次后，置于含有rhIL-4(100 ng/mL)、rhGM-CSF(100 ng/mL)的RPMI 1640培养液的六孔板中培养。37℃下在5% CO2培养箱中培养。24 h后更换培养液。第5天加入75 ng /mL的rhTNF-α。第7天观察细胞形态。并用CD11、MHCⅠ、MHCⅡ、CD40、CD80和CD86抗体联合标记的磁珠分选DCs细胞。即获得人未成熟DCs。
脐血分离培养PBMC见上述实验操作。脐血得到的PBMC细胞300×g离心10 min，沉淀用10% 1640培养基重悬后，置于37℃培养箱中1.0～1.5 h；培养上清液过滤后，300×g，离心10min，弃上清液，按照磁珠分选试剂盒(CD4＋T细胞分选试剂盒(Dynabeads™ Untouched™ Human CD4 Cells Kit)进行，沉淀用磁珠分选Buffer重悬(一般107个细胞用90 μL Buffer重悬)；加入10 μL磁珠，4℃下孵育15 min；然后加入2 mL Buffer，300×g离心10 min，用500 μL磁珠分选Buffer重悬沉淀；磁珠分选柱事先用500 μL磁珠分选Buffer洗涤3次(在整个过程中保证柱子不干，以免产生气泡，影响后续实验)；等到第3次洗涤，柱子快干时，加入重悬的细胞沉淀；磁珠分选Buffer洗涤3次，每次500 μL；等柱子中不再有液体流出时，加入1 mL磁珠分选Buffer，用注射器将细胞挤出并收集；流式计数，加入CD4＋ T细胞流式抗体4℃孵育15～30 min并收集鉴定CD4＋ T细胞的比例。CD4＋ T细胞培养条件：1640＋2 mmol/L谷氨酰胺＋1 mmol/L丙酮酸钠＋10%FBS＋0.5 U/mL IL-2培养。
以感染复数(MOI)为10，将BCG悬液加入DCs中后，37℃下5% CO2培养箱中孵育24 h。BCG感染的DCs与CD4＋初始T细胞共培养时，采用Transwell共培养体系(康宁，孔径8 μm)，上室培养CD4＋ T细胞为悬浮细胞，下室培养DCs细胞为贴壁细胞，在共培养前均单独培养，两者的比例约1∶1，细胞数量均约为1×105个，体积为100 μL，共培养24 h后上室收集离心，下室用细胞刮片收集后离心。
采用Lipofectamine 3000脂质体转染体系转染，转染时间为6 h，miRNA-99b siRNA或NC-siRNA转染浓度为15 pmol/L，转染后48 h检测miRNA抑制效率。
实时荧光定量PCR检测反应体系由全式金试剂(北京全式金公司)盒提供，操作按照说明书。反应条件：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40个循环。绘制溶解曲线，最终数据以2－△△Ct进行分析。Foxp3-F：TCCAGGACAGGCCACATTT；Foxp3-R：GGGATTTGGGAAGGTGCAGA；IFNγ-F：TGAATGTCCAACGCAAAGCA；IFNγ-R：CTGGGATGCTCTTCGACCTC；RORγt-F：CAACAGCAGCAACAGGAACC；RORγt-R：AGGGCTGTATTCAAGGTGGC；miRNA-99b-F：CACCCGTAGAACCGAC；miRNA-99b-R：GTGCAGGGTCCGAGGT。
采用SPSS 15.0对数据进行分析。计量资料采用
±s表示，采用独立样本t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
利用miRNA-99b及U6的特异性引物进行实时荧光定量PCR检测miRNA-99b的表达水平。结果发现，感染BCG的DCs中miRNA-99b基因转录水平(19.74±5.22)高于未感染BCG的DCs中的转录水平(2.18±0.80)(t＝7.06，P<0.05)，见图1。
注：a表示P<0.05
BCG感染DCs与CD4＋初始T淋巴细胞共培养后，收集CD4＋ T淋巴细胞，检测细胞内Foxp3、ROR-γt、IFN-γ、IL-10基因转录水平。结果发现，与CD4＋初始T淋巴细胞单独培养相比，和未感染BCG DCs共培养的CD4＋ T淋巴细胞中的Foxp3、IFN-γ、IL-10基因表达略增加，ROR-γt基因表达略降低，但差异均无统计学意义(P>0.05)。与未感染BCG DCs共培养的CD4＋初始T淋巴细胞相比，被BCG感染的DCs与共培养的CD4＋T淋巴细胞中的Foxp3基因转录增加，但差异无统计学意义[(4.50±2.26)比(1.33±0.86)，t＝2.44，P>0.05]；IFN-γ基因[(45.61±4.46)比(3.54±1.73)，t＝32.32，P<0.01]、IL-10基因[(4.17±1.06)比(1.26±0.67)，t＝2.24，P<0.05]转录水平增加；ROR-γt基因转录水平降低[(0.08±0.02)比(0.63±0.10)，t＝0.42，P<0.01]，见图2。
注：a表示P<0.05；b表示P<0.01；BCG.卡介苗；DCs.树突状细胞
与转染对照组(1.03±0.30)相比，miRNA-99b反义寡核苷酸转染DCs后，其miRNA-99b基因转录活性(0.50±0.14)显著下降(t＝3.37，P<0.05)，见图3。
注：a表示P<0.05
采用miRNA-99b siRNA转染DCs，与CD4＋初始T淋巴细胞共培养后，检测CD4＋初始T细胞中的相关基因转录情况。结果发现，与DCs和CD4＋初始T淋巴细胞共培养组相比，NC-siRNA转染的DCs与CD4＋初始T细胞共培养组的CD4＋初始T淋巴细胞中Foxp3、IFN-γ、IL-10、ROR-γt基因表达无统计学意义(P>0.05)。与NC-siRNA转染的DCs与CD4＋初始T细胞共培养组相比，阻断DCs中miRNA-99b的表达后，共培养的CD4＋初始T淋巴细胞Foxp3[(0.12±0.01)比(1.57±0.90)，t＝1.06，P<0.05]、IFN-γ基因[(0.03±0.01)比(0.64±0.35)，t＝0.44，P<0.05]、IL-10基因[(0.03±0.01)比(0.76±0.09)，t＝0.54，P<0.01]表达均显著降低，ROR-γt基因表达显著增加[(17.03±5.51)比(1.32±0.14)，t＝11.54，P<0.01]。见图4。
注：a表示P<0.05；b表示P<0.01；DCs.树突细胞
辅助性T细胞17(T help cell 17，Th17)和调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)是机体存在的两种不同于Th1和Th2的CD4＋ T细胞新亚型。Th17细胞介导炎症、延续破坏进程，Treg细胞对抗炎症、维持免疫耐受，机体正常状态下二者保持动态平衡[10]。CD4＋T淋巴细胞在转化生长因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)和IL-6的作用下分化为Th17，表达转录因子ROR-γt[11]，通过分泌IL-10、IL-17等多种效应因子介导IFN-γ依赖的抗结核炎症反应[12]。Treg细胞表型为CD4＋CD25＋，特异性表达Foxp3，其通过细胞-细胞接触机制或细胞因子分泌机制，抑制多种免疫细胞包括抗原提呈细胞的功能，对宿主抗结核免疫应答发挥负调控作用[13,14,15,16]。本研究发现，与BCG感染的DCs共培养后，CD4＋初始T淋巴细胞发生分化，其ROR-γt基因表达活性下降，Th17细胞亚群分化可能受到抑制，而Foxp3基因表达活跃，Treg细胞亚群分化可能增加。有研究发现，结核病患者无论是外周血还是胸腔积液中均可发现Th17/Treg分化失衡的现象，这一现象可能与结核病的发生、发展密切相关[4,17]。Th17与Treg淋巴细胞是抗结核适应性免疫应答的重要组成部分，而DCs是重要的抗原提呈细胞，是适应性细胞免疫应答的启动者之一[18]。DCs诱导Th17/Treg分化失衡的现象在真菌感染细胞免疫模型及自身免疫性疾病的研究中均有报道[19,20,21]。本研究使用牛型分枝杆菌减毒活菌-BCG感染人DCs，与新生儿脐血CD4＋初始T淋巴细胞共培养，CD4＋初始T淋巴细胞被诱导分化为Th17/Treg，发生一定程度的失衡，提示DCs诱导Th17/Treg分化失衡这一机制可能参与了结核分枝杆菌感染的过程。
临床研究发现，miRNAs在结核病患者除包括痰液在内的多种体液标本中均有特定的表达模式改变[22,23]。体外研究也表明，miRNAs参与了机体针对包括结核分枝杆菌在内的胞内菌感染的抗感染免疫过程[24,25]，所以其可能在抗结核固有免疫与适应性免疫机制的转换中发挥一定作用[26,27]。有研究发现[3]，在结核分枝杆菌标准菌株H37Rv感染的DCs和巨噬细胞中miRNA-99b显著升高；而以反义寡核苷酸阻断其表达后，DCs内结核分枝杆菌的生长明显受到抑制。同时发现，对DCs内miRNA-99b进行基因沉默处理后，可发现促炎细胞因子包括IL-10、IL-12和IL-1β等的表达明显升高。本研究发现，使用BCG感染体外培养的人DCs后，其细胞内miRNA-99b的表达显著升高，与之共培养的CD4＋初始T淋巴细胞被诱导分化为Th17/Treg发生失衡。而使用miRNA-99b反义寡核苷酸转染DCs并受BCG感染后，再与CD4＋初始T淋巴细胞共培养，发现Th17/Treg分化向相反方向发生偏移，提示结核分枝杆菌感染固有免疫环节的DCs，可通过miRNA-99b依赖的途径启动适应性免疫应答，影响CD4＋初始T淋巴细胞的分化，导致Th17/Treg细胞分化失衡。这一机制可能抑制了宿主适应性细胞免疫环节的相应效应细胞对结核分枝杆菌的清除，导致了结核感染病程的慢性化。本研究同时发现，伴随Th17细胞分化受到抑制及Treg细胞分化增加，IFN-γ、IL-10基因表达显著增加。而抑制DCs miRNA-99b基因后，共培养的CD4＋初始T淋巴细胞分化为Th17/Treg向相反方向发生偏移，相伴随的IFN-γ和IL-10基因表达显著下降。这与上述学者的研究结果不一致。结核肉芽肿的形成依赖IFN-γ和IL-10的作用[28]，而IFN-γ、IL-10基因表达的补偿性改变是不是宿主CD4＋T淋巴细胞分化受到结核杆菌干扰后的一种补充机制？相关具体机制及分子通路尚需进一步研究。
Singh等[3]发现在小鼠结核感染模型DCs中的miRNA-99b表达受抑制后会进而导致TNF-α和肿瘤坏死因子超家族4(TNFRSF-4)表达的增加，认为结核感染DCs可能通过miRNA-99b靶向作用于TNF-α和TNFRSF-4受体基因起作用。陈琳等[29]发现miRNA-99b通过靶向调节哺乳动物雷帕霉素靶分子(Mammalian target of rapamycin，mTOR)基因的表达，在人乳腺癌细胞对多柔比星的耐药机制中起作用。Kwon等[30]发现在小鼠关节炎及炎症性肠病模型中，可通过干预信号转导和转录激活蛋白信号通路(stat3信号通路)进而诱导Th17/Treg细胞失衡。Silva等[31]发现通过阻断TNF-α表达可损害宿主结核肉芽肿的形成并下调Th17和Treg等细胞因子的表达。这些信号通路可能是我们下一步研究的方向。鉴于结核分枝杆菌感染过程中宿主复杂的抗结核免疫调节过程，miRNA-99b究竟通过调节抗结核固有免疫及适应性免疫各环节的免疫细胞的哪些分子途径使结核分枝杆菌逃避免疫杀伤在宿主细胞顽强存活，其机制仍有待深入研究。
利益冲突 无
