探讨低水平HBsAg表达的慢性无症状HBV携带者(Asymptomatic chronic HBV carriers，ASCs)Pre-S基因序列特征及持续表达的分子机制。
收集2015年2月至2016年12月浙江大学医学院附属第一医院、杭州市第六人民医院、解放军第九〇三医院的654份ASCs血清标本和临床资料，根据HBsAg水平分为低水平HBsAg组(≤10 IU/mL)和高水平HBsAg组(>10 IU/mL)，并且在与低水平HBsAg组年龄匹配的基础上，从高水平组血清标本中随机抽样100份，对138例低水平HBsAg患者和100例高水平HBsAg患者进行Pre-S/S基因组扩增与测序，构建系统进化树确定基因亚型，以高水平HBsAg组的HBV Pre-S基因成功测序结果为基础建立中国东部地区ASCs主要基因型的Pre-S基因参考序列，并对低水平HBsAg组的ASCs Pre-S基因序列进行对比分析。采用SPSS 12.01统计软件对数据进行分析。
138例低水平HBsAg组Pre-S/S成功测序63例，其中B基因型52例，C基因型11例；100例高水平HBsAg组标本中Pre-S/S成功测序94例，其中B基因型48例，C基因型46例。通过序列比较分析发现，B基因型中，低水平HBsAg组Pre-S蛋白共发现81个氨基酸突变位点，其中有意义突变4个，分别为Pre-S1区F56I/V、T76A/N/P，Pre-S2区P15L/S/T、Y21T/F/H/N；高水平HBsAg组Pre-S蛋白发现47个氨基酸突变位点，其中有意义突变3个，为Pre-S1区L34F、V49A和P59S/L；B基因型中低水平HBsAg组的Pre-S蛋白氨基酸突变位点总数高于高水平HBsAg组，差异具有统计学意义(χ2＝14.008，P<0.05)。C基因型中，低水平HBsAg组Pre-S蛋白发现19个氨基酸突变位点，其中有意义突变3个，分别为Pre-S1区W66V/G和A79V，Pre-S2区V32A；高水平HBsAg组Pre-S蛋白发现39个氨基酸突变位点，其中有意义突变2个，为Pre-S1区A79V和Pre-S2区T49I；C基因型中Pre-S蛋白氨基酸突变位点总数在两组间差异有统计学意义(χ2＝7.571，P<0.05)。
ASCs Pre-S基因存在有意义的突变，这些突变可能与低水平HBsAg持续表达相关。
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乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒科，基因组长约3.2×103 bp，为部分环状双链DNA，HBV外膜蛋白包括Pre-S1、Pre-S2和S三种，分别由Pre-S1、Pre-S2、S区编码，Pre-S1、Pre-S2蛋白在病毒侵入肝细胞过程中以及在病毒感染、装配、复制和刺激机体产生免疫应答等方面发挥重要作用，Pre-S1蛋白的氨基酸(AA)21～47片段是HBV附着于肝细胞的最重要介导部位，而Pre-S2具有多聚人血清白蛋白(Polymerized human serum albumn，PHSA)的受体(PHSA-R)，HBV能通过PHSA介导经胞饮作用进入肝细胞内[1,2]。有文献报道Pre-S/S基因变异可导致免疫逃避、隐匿性HBV感染[3,4]，血清学检测时表现为HBsAg和抗-HBs同时存在或HBsAg阴性；也有文献报道感染过程中HBsAg的表达受到HBV逆转录酶的高自发误差率、不断发生的病毒变异以及内源性和外源性选择压力的影响[5,6]，其中Pre-S基因的突变会影响HBsAg的表达[2,7]。然而，在HBV感染者的自然进程中，以血清低水平HBsAg持续表达、HBV DNA低复制为主要特征的慢性无症状HBV携带者(Asymptomatic chronic HBV carriers，ASCs)与Pre-S基因突变有关的研究数据很少，为此，本文对持续高水平、低水平HBsAg表达的ASCs Pre-S基因进行测序，与已建立的持续高水平HBsAg表达的ASCs Pre-S基因参考序列进行比较，以揭示其Pre-S基因序列特征，探讨ASCs持续低水平HBsAg表达的形成机制，对乙型肝炎防治，尤其是低水平HBsAg人群HBV感染防治具有指导意义。
收集2015年2月至2016年12月浙江大学医学院附属第一医院、杭州市第六人民医院、解放军第九〇三医院标本库的654份ASCs血清标本和临床资料，其中女性234例，男性420例，病例主要分布在中国东部地区(浙江、安徽、上海、江苏、江西、福建、山东)。依据HBsAg水平进行分组[8]：HBsAg≤10 IU/mL为低水平HBsAg组，共138例，HBsAg>10 IU/mL为高水平HBsAg组，共516例，并在与低水平HBsAg组年龄匹配的基础上，从高水平组血清标本中随机抽样100例进行测序。低水平HBsAg的ASCs入组标准[9,10,11]：(1)经过1年以上的随访，血清HBsAg检测结果3次以上均在10 IU/mL以下；(2)HBsAg(＋)持续6个月以上；(3)无肝病相关的症状和体征；(4)血清丙氨酸转氨酶(ALT)正常。排除标准[11,12,13]：(1)合并感染人免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)等病例；(2)HBV急性感染(急性肝炎)或早期感染出现的低水平HBsAg病例；(3)恢复期HBsAg/抗-HBs转换阶段出现的低水平HBsAg病例；(4)HBsAg/抗-HBs阳性长期共存的病例；(5)标本收集前6个月内有服用过肝保护剂、酶抑制剂、免疫调节剂或抗病毒药物史的病例。该研究符合《赫尔辛基宣言》。
ALT和血清学标志物(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc)分别采用雅培C16000全自动生化分析仪和雅培I2000免疫分析仪进行测定，并进行中和实验确认。HBsAg的线性范围为0.05～250.00 IU/mL，如果HBsAg水平超出检测线，对标本按照1∶100使用专用稀释液进行稀释后检测，以上均严格按照说明书要求进行操作。
采用NP968核酸提取系统及核酸提取试剂盒(苏州天隆生物科技有限公司)，荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测试剂盒(艾康生物技术有限公司)和ABI Step-One-Plus实时PCR系统(Applied Biosystems)测定所有样品中HBV DNA的水平。引物序列如下：正向5′-TTCC TCTTCATCCTGCTGCTGCT-3′；反向5′-AGTTTCCGT CCGAAGGTTTT-3′；荧光探针，5′-FAM-ATCAACTAC CAGCACGGG ACBHQ1′-3′。扩增程序如下：95℃预热3 min，然后进行45次扩增，其中94℃加热15 s，58℃加热30 s。
本研究扩增和测序引物设计见表1，由上海生工生物工程股份有限公司完成测序工作。PCR扩增反应体系为：每25 μL反应管中包括5 μL 5×KAPA2G缓冲液A，5 μL 5×KAPA增强液，0.1 μL KAPA2G Robust HotStart DNA聚合酶，0.5 μL 10 μmol/L dNTP Mix(日本Takara Bio)，上下引物各1 μL，3 μL DNA模板，用PCR专用水补足至25 μL。通过KAPA2G Robust HotStart PCR试剂盒进行扩增，共两轮，第一轮扩增：95℃ 3 min预变性，然后再5个循环95℃ 30 s，退火温度由57℃降至53℃，每一循环降低1℃，退火时间30 s，延伸72℃ 30 s，接着30个循环为：95℃ 30 s，Ta(53℃) 30 s，72℃ 30 s最后延伸72℃ 2 min；第二轮扩增反应的条件与反应体系与第一轮相同，而第二轮的DNA模板为第一轮的PCR扩增产物。对PCR产物进行测序，测序结果使用Lasergene软件中的SeqMan对获得的序列进行序列拼接和分析，然后使用Blast(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对。
用于扩增HBV Pre-S/S基因的引物
用于扩增HBV Pre-S/S基因的引物
| 引物 | 序列(5′→3′) | 位置(nt) |
|---|---|---|
| ⅠF | ACCWTATWCYTGGGAACAA | 2 819～2 837 |
| ⅠR | TCAGCAAAYACTYGGCA | 1 190～1 174 |
| ⅠaF | ACCWTATWCYTGGGAACAA | 2 819～2 837 |
| ⅠaR | GAYGAYGGGATGGGAATACA | 617～598 |
| ⅠbF | GACTYGTGGTGGACTTCTC | 251～269 |
| ⅠbR | TCAGCAAAYACTYGGCA | 1 190～1 174 |
利用MEGA v6.0软件对多个目的片段拼接完成的Pre-S/S基因进行比对[14]，并采用邻位相接法对测序获得的序列与美国国立生物技术信息中心(NCBI)推荐的代表B、C基因型的参考序列B(AB033554、AF100309和D00329)、C(AB014381、AY123041和X046)[15]构建系统发育进化树和基因分型(S基因同源性≥96%即为同一基因型)[16]。
以100例高水平HBsAg组的Pre-S基因成功测序结果为基础，以各主要基因型(B、C)序列中相同位置同一碱基出现频率最高的碱基作为参照碱基建立中国东部地区ASC的B基因型Pre-S参考序列(ASC-R-Pre-S-B)和C基因型Pre-S参考序列(ASC-R-Pre-S-C)。为了验证本文建立的ASC-R-Pre-S-B、ASC-R-Pre-S-C的正确性和可用性，分别与NCBI中ASC的B、C基因型序列(NCBI-ASC-Pre-S-B组、NCBI-ASC-Pre-S-C组)及NCBI推荐的HBV B、C型参考序列(NCBI-R-Pre-S-B：AB033554、AF100309和D00329；NCBI-R-Pre-S-C：AB014381、AY123041和X04615)进行同源性分析[15]。
采用SPSS 12.01软件进行分析。符合正态分布的计量资料以
±s表示，采用t检验，非正态分布的计量资料用中位数(M)和上下四分位数间距(P25，P75)表示，采用Mann-Whitney U检验；计数资料用例(百分数)表示，采用χ2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
低水平HBsAg组患者平均年龄大于高水平HBsAg组(t＝6.193，P<0.05)，HBV DNA水平的平均值低于高水平HBsAg组(u＝7 816.000，P<0.05) (表2)。在138例低水平HBsAg组标本中Pre-S/S成功测序63例，其中B基因型52例，C基因型11例；100例高水平HBsAg组标本中Pre-S/S成功测序94例，其中B基因型48例，C基因型46例。
慢性无症状HBV携带者低水平HBsAg组和高水平HBsAg组的临床资料
慢性无症状HBV携带者低水平HBsAg组和高水平HBsAg组的临床资料
| 一般资料 | 低水平HBsAg组(n＝138) | 高水平HBsAg组(n＝516) | χ2/t/u值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| 性别(例，男/女) | 84/54 | 336/180 | 0.680 | >0.05 |
年龄(岁， ±s) | 55.1±16.4 | 43.6±11.0 | 6.193 | <0.05 |
| HBsAg[IU/mL，M(P25，P75)] | 3.5(0.98，6.66) | 935(200.63，375.45) | 126.000 | <0.05 |
| HBV DNA[lgIU/mL，M(P25，P75)] | 24.73(0，397.67) | 6.5×103(1.54×103，5.23×107) | 7 816.000 | <0.05 |
| HBV DNA阳性率[例(%)] | 63(45.65) | 94(94.00) | 58.236 | <0.05 |
分别以高水平HBsAg组B、C基因型各序列中相同位置同一碱基出现频率最高的碱基作为参照碱基，建立ASC-R-Pre-S-B和ASC-R-Pre-S-C，结果见图1。与NCBI-ASC-Pre-S-B、NCBI-ASC-Pre-S-C及NCBI-R-Pre-S-B、NCBI-R-Pre-S-C进行核苷酸和氨基酸同源性分析，发现建立的ASC-R-Pre-S-B和ASC-R-Pre-S-C分别与中国大多数地区报道的ASC的B和C基因型Pre-S序列具有非常高的同源性(99.2%～100.0%)，与NCBI推荐的亚洲B和C基因型多数Pre-S参考序列具有较高的同源性(98.2%～99.5%)，而距中国较远地区则同源性偏低(加拿大和印度尼西亚，96.4%～96.9%)(表3)。
ASC-R-Pre-S-B、ASC-R-Pre-S-C与NCBI-ASC-Pre-S-B、NCBI-ASC-Pre-S-C、NCBI-R-Pre-S-B、NCBI-R-Pre-S-C的Pre-S基因序列同源性分析(%)
ASC-R-Pre-S-B、ASC-R-Pre-S-C与NCBI-ASC-Pre-S-B、NCBI-ASC-Pre-S-C、NCBI-R-Pre-S-B、NCBI-R-Pre-S-C的Pre-S基因序列同源性分析(%)
| 参考序列 | 比较序列 | 序列号 | 地区 | 同源性 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 核苷酸 | 氨基酸 | ||||
| ASC-R-Pre-S-B | NCBI-ASC-Pre-S-B | JX661484 | 上海 | 99.4 | 100.0 |
| JX661473 | 上海 | 99.5 | 99.2 | ||
| JN406371 | 武汉 | 99.5 | 99.0 | ||
| KY470957 | 云南 | 99.6 | 99.2 | ||
| KY470963 | 云南 | 99.4 | 98.7 | ||
| DQ463800 | 加拿大 | 96.5 | 96.9 | ||
| DQ463801 | 加拿大 | 96.4 | 96.4 | ||
| NCBI-R-Pre-S-B | D00329 | 日本 | 98.7 | 99.2 | |
| AF100309 | 上海 | 99.4 | 98.7 | ||
| AB033554 | 印度尼西亚 | 96.5 | 96.4 | ||
| ASC-R-Pre-S-C | NCBI-ASC-Pre-S-C | EU306721 | 云南 | 99.2 | 99.0 |
| EU439007 | 云南 | 98.9 | 98.5 | ||
| JX661496 | 上海 | 99.4 | 99.2 | ||
| JX661498 | 上海 | 99.1 | 98.7 | ||
| AY641558 | 韩国 | 99.2 | 99.5 | ||
| AY641560 | 韩国 | 98.9 | 99.0 | ||
| AB033556 | 日本 | 98.8 | 99.2 | ||
| AB222715 | 日本 | 99.3 | 99.2 | ||
| NCBI-R-Pre-S-C | AB014381 | 日本 | 99.1 | 98.7 | |
| AY123041 | 日本 | 98.8 | 98.2 | ||
| X04615 | 日本 | 98.9 | 98.7 | ||
注：ASC.慢性无症状HBV携带者；NCBI.美国国立生物技术信息中心；ASC-R-Pre-S-B和ASC-R-Pre-S-C.本文建立的ASC的B、C基因型Pre-S参考序列；NCBI-ASC-Pre-S-B和NCBI-ASC-Pre-S-C. NCBI中上传的ASC的B、C基因型Pre-S序列；NCBI-R-Pre-S-B和NCBI-R-Pre-S-C.NCBI推荐的B、C基因型Pre-S参考序列
注：A. ASC的B基因型Pre-S核苷酸参考序列；B.ASC的B基因型Pre-S氨基酸参考序列；C.ASC的C基因型Pre-S核苷酸参考序列；D.ASC的C基因型Pre-S氨基酸参考序列
本文建立的ASC-R-Pre-S-B、ASC-R-Pre-S-C参考序列分别与低水平HBsAg组的B、C基因型Pre-S基因氨基酸序列的163位氨基酸位点进行比较分析：B基因型中，低水平HBsAg组Pre-S蛋白共发现81个氨基酸突变位点，其中包括热点突变15个，非热点突变66个；有意义突变4个(表4)，无意义突变77个；高水平HBsAg组Pre-S蛋白发现47个氨基酸突变位点，其中包括热点突变10个，非热点突变37个；有意义突变3个(表4)，无意义突变44个；低水平HBsAg组Pre-S蛋白氨基酸突变位点总数高于高水平HBsAg组(χ2＝14.008，P<0.05)，而热点突变位点数在两组间差异无统计学意义(χ2＝0.693，P>0.05)(图2A，图2B)。C基因型中，低水平HBsAg组Pre-S蛋白发现19个氨基酸突变位点，其中包括热点突变4个，非热点突变15个；有意义突变3个(表4)，无意义突变16个；高水平HBsAg组Pre-S蛋白发现39个氨基酸突变位点，其中包括热点突变4个，非热点突变35个；有意义突变2个(表4)，无意义突变37个；Pre-S蛋白氨基酸突变位点总数在两组间差异有统计学意义(χ2＝7.571，P<0.05)，热点突变位点数在两组间的差异无统计学意义(χ2＝0.128，P>0.05)(图2C，图2D)。
慢性无症状HBV携带者B、C基因型Pre-S1、Pre-S2蛋白氨基酸有意义突变位点特征
慢性无症状HBV携带者B、C基因型Pre-S1、Pre-S2蛋白氨基酸有意义突变位点特征
| 组别 | 例数 | Pre-S1 | Pre-S2 | |
|---|---|---|---|---|
| 低水平HBsAg组 | ||||
| B基因型 | 52 | F56I/V(6)，T76A/N/P(6) | P15L/S/T(6)，Y21T/F/H/N(6) | |
| C基因型 | 11 | W66V/G(2)，A79V(7) | V32A(2) | |
| 高水平HBsAg组 | ||||
| B基因型 | 48 | L34F(6)，V49A(4)，P59S/L(4) | 未检出 | |
| C基因型 | 46 | A79V(14) | T49I(12) | |
注：A.低水平HBsAg组B基因型；B.高水平HBsAg组B基因型；C.低水平HBsAg组C基因型；D.高水平HBsAg组C基因型
血清HBsAg筛查是HBV感染诊断的重要血清学指标，也是乙型肝炎治疗效果的重要参考指标[20]。近年来，由于疫苗接种的普及、临床抗病毒药物的广泛应用等多重因素的作用，导致一定比例的慢性HBV感染者血清低水平HBsAg表达，据文献报道，低水平HBsAg检出率占HBsAg阳性总数的6.9%～23.2%[21]，且低水平HBsAg表达的患者呈HBV DNA低复制现象，所以其存在一定程度的肝脏损伤和传播风险，一旦发生漏检，将给手术、输血以及乙型肝炎治疗的评估带来严重的安全问题。
Pre-S区基因是整个HBV全基因中异质性最高的区域，易发生不同类型的突变，突变通常包括替换、插入、缺失等类型。Pre-S区涵盖了在病毒生命周期中发挥关键作用的结构位点(如肝细胞结合区域、PHSA结合位点、S启动子等)和大量的抗原表位(T、B淋巴细胞抗原表位)。目前低水平HBsAg形成机制中有关Pre-S区突变研究的热点主要集中在：(1)发生在Pre-S区结构位点上的突变。Pre-S启动子区域突变可降低启动子活性，导致小S蛋白转录产物减少，大S蛋白和小S蛋白比例发生改变，从而引起HBsAg合成失衡或在肝细胞内滞留，影响病毒颗粒的分泌[2,22]；另外，PHSA结合位点调节HBV对肝细胞的附着、侵入，介导HBV和肝细胞上的受体结合，肝细胞结合区域参与病毒颗粒的装配和分泌。因此，PHSA结合位点、肝细胞结合区域发生突变可影响HBV与肝细胞上受体的结合率和病毒分泌效率，进而降低HBV的感染性[23,24]。(2)T、B淋巴细胞抗原表位区域突变。此区域发生突变可能引起免疫靶抗原改变，出现免疫逃避或影响主要组织相溶性复合体(MHC)限制性T细胞对抗原的识别，病毒得以逃避宿主的免疫监视，在体内呈低水平复制[25,26]；(3)缺失突变，主要发生在Pre-S1 3′端和Pre-S2 5′端，Pre-S基因的缺失突变可能导致病毒的感染性、分泌能力、免疫原性及抗原抗体的结合能力发生改变[22]，但由于不同个体的缺失区域和缺失片段长度存在差异，Pre-S1和Pre-S2缺失突变在低水平HBsAg人群发生和发展过程中的作用机制还需进一步研究阐明。以上研究均提示Pre-S区突变与血清中低水平HBsAg表达可能存在一定的关联性。
本研究分析了HBsAg低水平表达的慢性HBV感染者Pre-S1和Pre-S2序列特征，结果显示：(1)在B基因型中，发现7个有意义的单位点突变(Pre-S1 5个，Pre-S2 2个)，且低水平HBsAg组Pre-S蛋白氨基酸突变位点数目高于高水平HBsAg组(P<0.05)，其中B基因型Pre-S1区热点突变(T76A)、Pre-S2区热点突变(P15L、Y21T)均位于B细胞免疫识别表位，另外P15L突变也位于PHSA-R结合位点区域，此位点的突变可能造成Pre-S区的双重变异[27]；(2)在C基因型中，发现4个有意义的单位点突变(Pre-S1 2个，Pre-S2 2个)，且Pre-S蛋白氨基酸突变位点数目在两组之间的差异有统计学意义(P<0.05)，其中C基因型Pre-S2区热点突变(V32A)位于辅助性T淋巴细胞(Th细胞)免疫识别表位。以上在本研究中发现的4个有意义的位点突变发生在Pre-S功能区或T、B识别表位，由此推测这些位点突变在机体中介导的产生机制可能是通过改变病毒的抗原性、结合位点识别能力和/或降低病毒对肝细胞结合率、S蛋白表达以及分泌能力等进而影响血清中HBsAg的表达[2,7,28]，是否如本研究推测，有待于进一步构建HBV低水平HBsAg感染的细胞模型，对已发现的突变位点进行验证，从而阐明血清低水平HBsAg产生机制。
综上所述，低水平HBsAg人群具有特征性的血清和分子流行病学特点，其产生机制与Pre-S基因突变密切相关，主要为Pre-S基因突变造成了免疫逃逸、S蛋白表达量改变、HBV肝细胞受体结合率和病毒分泌效率降低等，进而使病毒在低载量状态下持续存在，而突变的具体生物学功能和意义还有待于更深入的研究和分析验证。
志谢：本研究样本由浙江大学医学院附属第一医院和杭州市第六人民医院收集，在此表示由衷的感谢。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
