疟疾是旅行归来者发热最常见的原因，因检测手段的局限，常被误诊和漏诊。本文报道1例35岁中国男子从尼日利亚回国后发烧10 d，外周血疟原虫涂片3次及血培养3套均为阴性，同步进行的血宏基因二代基因检测技术(mNGS)提示三日疟，治疗后迅速好转，后经PCR确诊。本例病例报告提示mNGS可帮助临床医师快速精准识别疟疾感染。
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据世界卫生组织(WHO)统计，2016年全球有2.1亿人感染疟疾，造成44.5万人死亡，90%的疟疾发生于非洲。随着耐药疟疾的逐渐增多，疟疾的疫情控制面临严峻挑战[1]。疟疾是旅行者归来发热最常见的原因，随着国际旅行越来越普遍，我国临床医师在考虑旅行归来发热待查患者的病原体谱时，需要考虑到疟疾[2]。
疟疾诊断的金标准为血涂片镜检找疟原虫，其他方法包括血清抗原快速检测及分子生物学技术[3]。宏基因二代基因检测技术(mNGS)作为一种新型的感染性疾病的诊断工具，已越来越多的被用于临床。已有不少文献报道mNGS在细菌、真菌感染方面的诊断价值[4]，关于寄生虫的相关报道极少，该文采用mNGS诊断三日疟1例，现报道如下。
患者男，35岁，因"反复发热10 d余"于2018年10月17日收治入院。10月6日，患者自觉发热不适，体温38.5℃，口服退热药物后退热。次日起床后乏力明显，伴双膝关节及后腰部酸胀感。10月7日、10日均因发热至当地医院就诊，查血培养1套，血涂片找疟原虫2次均为阴性，服用退热药物后热退。此后又间断发热2次。患者诉既往在非洲尼日利亚工作6年，今年7月曾在当地诊断为疟疾2次，2次感染间隔8 d，分别为间日疟和恶性疟，均予青蒿素＋头孢类抗生素治疗后热退。9月26日，患者从尼日利亚回国。入院查体：体温36℃，脉搏88次/min，呼吸18次/min，血压108/82 mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)。精神尚可，食欲下降，体力、体质量无明显变化。皮肤巩膜无黄染，全身浅表淋巴结未及肿大。双肺听诊呼吸音清，未闻及啰音。心脏听诊无杂音，双下肢无水肿。腹部平软，肝脾肋下未及。实验室检查：外周血白细胞(WBC)6.31×109/L，血小板(PLT)130×109/L，血红蛋白(Hb) 142 g/L，嗜酸性粒细胞1.1×109/L，C-反应蛋白(CRP)56.8 mg/L，降钙素原(PCT)0.46 ng/mL，红细胞沉降率(ESR)21 mm/1 h，总胆红素26.5 μmol/L，直接胆红素12.2 mol/L，抗核抗体1∶320，肿瘤标记物阴性，血培养2套阴性，巨细胞病毒(CMV)DNA(－)，单个核EB病毒DNA 5.81×106，血浆EB病毒DNA(－)，T-SPOT A/B 0/1，完善立克次体核酸＋抗体、寄生虫抗体(囊虫、肺吸虫及华支睾吸虫等)、利氏曼原虫抗体、布尼亚病毒抗体＋核酸、疟疾血涂片，为尽早明确发热病原体，同时行血mNGS检测。胸腹部增强CT结果示脾脏增大；头颅MRI＋增强：未见明显异常。
患者入院后前2 d未有发热，10月19日体温上升至38.3℃，有发冷，无寒战。10月18日，血涂片回报阴性。10月20日，血清立克次体核酸和抗体、寄生虫、利氏曼原虫、布尼亚抗体＋核酸回报均为阴性，血mNGS结果示疟原虫属相对丰度(指属水平上检测到的该微生物在整个样本中检测到的相同类型微生物中所占的比重)93.17%，标化后属严格比对序列数(属水平上严格比对上该属物种的序列数)1 220，标化后种严格序列数(种水平上严格比对上该物种的序列数)181，三日疟占mNGS病原体总覆盖度(指检测到的该微生物核酸序列覆盖到该微生物整个基因组序列的比值)0.136%。予以青蒿素阿莫地奎片2片，1次/d，服用3 d后热退出院。10月22日，复查血常规及炎症指标均正常。10月24日，PCR结果回报证实三日疟。
取300 μL血浆，使用TIANamp Micro DNA Kit (DP316，天根生化科技北京有限公司)，根据试剂盒说明书提取DNA。提取的DNA用作DNA文库构建。
使用Agilent 2100 Bioan- alyzer对文库打断片段的长度进行质控分析，使用Qubit dsDNA HS Asay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc.)对DNA文库浓度进行质控分析，经环化形成单链环形结构。环化后的文库经滚环复制(RCA)生成DNB纳米球。制备好的DNB纳米球加载到测序芯片。使用BGISEQ-500进行测序。
测序数据下机后去除低质量的和长度<35 bp的数据以获得高质量的数据。通过Burrows-wheeler aligne(BWA：http：//bio-bwa.sourceforge.net/)比对，将高质量数据中比对上人参考基因组序列的数据去除。剩下的数据在去除低复杂度序列后与专用的微生物大数据库比对，并将比对后的数据按照病毒、细菌、真菌和寄生虫等进行分类和排列。
疟疾为旅行者归来发热的首要原因，比例高达21%，来自撒哈拉以南非洲地区旅行归来患者疟疾引起的发热比例高达42%[5]。由于疟疾起病为非特异性表现，与其他常见的发热性疾病难以区分，容易被漏诊，以致逐渐发展为重症疟疾并导致死亡。因此，临床医师面对旅行归来发热的患者，不应遗漏疟疾。
疟疾诊断方法包括显微镜检查、检测抗原的快速诊断试验(RDTs)和分子生物学技术(PCR)。有研究表明，血涂片的阳性率为56%，11%患者可以通过血涂片正确鉴定疟原虫的种类[6]，RDTs的敏感度与血涂片相当[7]。在我国，血涂片为常用的疟疾筛查手段，由于血液涂片的敏感度和特异度较低，加之实验室技术员经验不足，实际的敏感度可能更低。临床医师高度怀疑疟疾时，可行PCR检查[8]。PCR只能检测有限种类病原体，在发热原因不明及鉴别诊断较多时，无法快速给临床医师提供思路。2016年英国疟疾治疗指南推荐疟疾的诊断和治疗都应尽早进行[9]。
mNGS是一种新型的病原体基因组学诊断技术，有助于临床医师诊断病原体未知的感染性疾病[10,11]、发现培养无法发现的病原体[12]、通过监测微生态提前预测感染[13]、预测药物敏感性[14]，比传统检测手段结果更快更精准。同时，也存在需进一步减少人员序列[15]、无法避免操作过程中的污染[16]，尚无明确标准界定感染、定植还是污染、费用较高、市场基因公司鱼龙混杂等缺点。感染病科医师根据患者疾病疑难危重复杂的程度、患者经济条件等多方面因素选择正规的机构进行检测，同时应通过不断充实自己的专业知识正确解读病原学报告。
本例报告是在我国首次采用mNGS技术检测到疟原虫，经疟原虫PCR证实。我院作为mNGS技术最早与临床接轨的医院之一，至今已有超过2 000例标本的检测经验，曾检测出耶氏肺孢子菌、东方立克次体、巴尔通体、鹦鹉热衣原体、猪疱疹病毒、腺病毒等常规培养无法检测到的有临床意义的病原体。目前mNGS经常被应用于疑难复杂感染病例，因其可检测的病原体范围广泛，面对不明原因的发热时，可帮助临床医师及时发现罕见或意想不到的病原体，极大加快了诊断速度，可改善患者预后。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
