比较腺相关病毒(AAV)不同血清型对小鼠视网膜层的趋向性。
构建pFastBacDual-inCap衣壳质粒和pFastBacDual-ITR-CMV-EGFP基因组质粒；包装重组腺相关病毒2型(rAAV2)、rAAV6、rAAV8、rAAV9；以感染复数(MOI)2000的比例感染HEK293T细胞，24 h后观察荧光表达；应用随机数字表法将C57BL/6小鼠分为rAAV2、rAAV6、rAAV8、rAAV9组和对照组，每组5只，分别双眼玻璃体腔注射rAAV2、rAAV6、rAAV8、rAAV9和磷酸盐缓冲液(PBS)各1 μl，注射后2周，制作眼球冰冻切片以及视网膜铺片，分别应用倒置荧光显微镜和激光扫描共焦显微镜观察rAAV不同血清型增强型绿色荧光蛋白(EGFP)荧光强度和感染部位。应用倒置荧光显微镜观察玻璃体腔注射rAAV2后2周、1个月、3个月EGFP荧光强度变化。
重组病毒对HEK293T的感染效率从高到低依次为rAAV2、rAAV6、rAAV8和rAAV9，转导效率分别为39.5%、18.4%、8.7%和4.6%；在小鼠视网膜中，rAAV2和rAAV6在神经节细胞表达水平较高，rAAV8和rAAV9在视网膜色素上皮(RPE)和光感受器细胞中表达水平较高；rAAV2介导EGFP可于注射后2周、1个月、3个月内在视网膜稳定表达。
rAAV不同血清型对视网膜RPE细胞和神经节细胞具有高趋向性和高效表达，rAAV2玻璃体腔注射后转导效率较高，且在注射后3个月内稳定表达。
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视网膜疾病是主要的致盲眼病之一，由先天基因突变或后天疾病引起，常见的有黄斑变性、糖尿病视网膜病变、青光眼、遗传性视网膜病变等。遗传性视网膜疾病(inherited retinal degenerations，IRD)由于视网膜神经层或色素层基因突变，进而视神经细胞或感光细胞功能衰退，视细胞死亡，因此致盲[1]。遗传性视网膜疾病主要有Leber先天性黑矇、视网膜色素变性、先天性静止性夜盲、Stargardt病、Usher综合征等[2]，目前临床上尚无法根治。随着生命科学领域的发展和对人类基因的深入研究，通过基因治疗有可能使正确基因表达或敲除异常基因，进而起到恢复视功能的作用[3,4,5]。病毒载体稳定高效转导外源目的基因，在基因治疗中应用广泛。腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)是当前最有价值的基因治疗病毒载体之一，具有安全性高、免疫原性低、定点整合、感染范围广等特点[6,7,8]。其中，AAV载体主要给药途径有玻璃体腔注射和视网膜下注射[9]。目前临床上转导视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)和光感受器的手段是视网膜下注射，将针头置于视网膜与RPE之间，注入病毒，上方视网膜会形成泡状膜脱离，但该注射可能会引起炎症，并且手术操作困难，安全性低[10]。玻璃体腔注射是将病毒直接注入玻璃体腔，病毒悬液随玻璃体扩散入视网膜，此方法更安全、容易。研究表明，玻璃体腔注射主要转导神经节细胞，对RPE、光感受器等视网膜外层细胞转导率低，临床应用有限[11,12]。提高玻璃体腔注射对视网膜外层细胞的转导效率可增加玻璃体腔注射的临床使用率[13]，降低手术风险和难度。选择合适的具有靶向性的AAV有助于增加玻璃体腔注射对外层视网膜的转导效率。AAV有多种血清型，不同血清型有特异的识别受体，因此会有不同靶向目标[14]。根据疾病部位和靶向组织选择合适的AAV血清型能大大提高转导效率。另有研究证明，将AAV的衣壳(Capsid，Cap)基因序列起始端插入含昆虫细胞启动子序列的内含子片段可显著提高昆虫细胞表达系统包装的AAV表达[15,16]。本实验采用的病毒包装为昆虫细胞表达系统，在衣壳序列起始处添加内含子序列，选择重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)2、6、8、9血清型进行小鼠玻璃体腔注射，比较rAAV不同血清型转导视网膜的能力及趋向性。
