探究体外将人诱导多能干细胞(hiPSCs)定向分化成视网膜类器官(ROs)的进程并进行小鼠在体细胞移植。
使用定向分化培养基使BC1-eGFP hiPSCs悬浮培养得到神经球，培养第7天时将神经球贴壁培养诱导出神经视网膜上皮结构，然后人工分离类视网膜结构悬浮培养，进一步定向诱导分化得到成熟的ROs。采用实时荧光定量PCR检测培养第0、7、15、21和30周标志基因的表达水平变化，采用免疫荧光染色法检测培养第8天、第15天、第15周、第21周和第30周标志基因的蛋白水平变化来鉴定诱导分化进程及效果。在体移植ROs实验中，首先破坏外界膜，然后将经消化的RO细胞悬液从角巩膜缘注射到Gnat1-/-小鼠视网膜下腔，细胞移植后5个月进行视网膜切片的免疫荧光染色检测植入细胞的存活情况、与宿主视网膜的整合以及进一步的成熟分化情况。
形态学和免疫荧光染色结果显示，体外诱导hiPSCs早期形成的眼区细胞高表达神经视网膜上皮特异性标志物PAX6和SOX1，随后细胞可以表达视网膜祖细胞特异性标志物LHX2，集落外圈逐渐形成圆形透明马蹄状的类视网膜结构。机械分离并悬浮培养得到的ROs直径约为1 mm，类视网膜组织逐渐增厚并出现类视网膜色素上皮细胞。实时荧光定量PCR结果显示视网膜祖细胞标志基因VSX2表达在第7周即达峰值并持续高表达(F＝168.30，P<0.01)，视网膜前体细胞标志基因RCVRN在第7周也开始出现并逐渐高表达(F＝271.60，P<0.01)，感光蛋白基因RHO在第15周开始表达(F＝95.02，P<0.01)，而成熟感光细胞标志OPN1LW/MW的表达在第21周明显升高(F＝40.57，P<0.01)。免疫荧光染色进一步检测到感光蛋白RHO在第30周达高表达状态。RO细胞移植后3周，自身带有绿色荧光的细胞成功在宿主小鼠的视网膜外核层中长期存活，移植后5个月植入细胞表达功能性光信号转导蛋白GNAT1。
体外3D培养诱导hiPSCs生成ROs可成功地模拟人体内视网膜的发育过程，移植的RO细胞能在受体小鼠眼内长期存活，进入外核层并进一步发育成熟为类感光细胞。
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胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)技术的相继建立为各类退行性疾病提供了新的细胞替代治疗方案，突破了细胞来源和伦理问题的局限[1,2]。研究发现，逆转录病毒介导的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4个外源基因转入小鼠成纤维细胞可得到iPSCs，其在形态学、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、分化能力等方面都与ESCs极为相似[2]。iPSCs可作为疾病模型，在潜在治疗方式中有一定作用，实现了造血干细胞、免疫细胞、心肌细胞和神经元等的体外获取，助力细胞移植治疗；同时，利用iPSCs已成功分化出心脏、迷你肾脏和微型大脑等近似于人类器官的3D组织模型，在疾病研究、药物筛选和毒理测试领域展现出强大的潜力[3]。目前，已有多项iPSCs向感光细胞、视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞、神经节细胞(ganglion cell，GC)系分化的相关研究[4,5]。有研究者提出了体外3D视网膜分化的方法，使干细胞在体外自发形成符合体内发育规律的视网膜类器官(retinal organoids，ROs)[6]。ROs的分层情况与体内视网膜类似，包含基本的视网膜细胞类型，如GCs、无长突细胞、水平细胞、双极细胞、Müller胶质细胞和感光细胞。ROs分化方法不断得到优化。Zhong等[7]在体外获得具有类外段结构的成熟感光细胞，并通过单细胞感光电生理证实小部分感光细胞存在光反应。ROs 3D模型的建立极大地推动了视网膜发育和疾病治疗的开展。多组学研究揭示了人胚胎视网膜与ROs在发育和分化过程中染色质开放和基因表达动态变化的共性和差异，扩展了对视网膜发育过程的理解[8]。随着体细胞重编程技术与基因编辑技术不断发展，可通过视网膜色素变性患者尿液样本建立iPSCs，并分化成患者特异的ROs用于药物筛选，为感光细胞移植提供有用资源[9]。在人ESCs来源的ROs中采用细胞表面标记分选策略有效排除了具有成瘤风险的早期胚胎细胞，选用特定视网膜祖细胞群体进行移植，这些细胞可以主动调节变性和损伤微环境，延长治疗时间，且易于标准化和产业化，具有广阔的临床转化前景[10]。本研究旨在探究人iPSCs(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)诱导分化成ROs的具体进程以及干细胞移植对视网膜退行性疾病的治疗作用。体外诱导hiPSCs分化得到成熟的ROs，并检测不同时间点ROs的类感光细胞结构和视网膜相关基因及蛋白表达，以用于视觉受损小鼠的在体移植治疗，为视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性等视网膜退行性疾病的细胞替代治疗提供实验基础。
