构建表达视觉系统同源框2(VSX2)增强绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因的人诱导多能干细胞系(hiPSCs)。
根据成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术原理，设计VSX2的小向导RNA(sgRNA)，构建敲除质粒及包含左右同源臂的P2A-eGFP供体质粒；2个质粒经测序鉴定后电转野生BC1-hiPSCs细胞系，采用嘌呤霉素筛选获得单克隆，扩增培养并鉴定。采用PCR和Sanger测序鉴定基因型；采用核型分析法分析报告细胞系核型；采用STR法排除细胞交叉污染；采用免疫荧光法及逆转录PCR法检测报告细胞系的多能干细胞分子标志物的表达；通过体外三胚层形成实验鉴定报告细胞系向三胚层分化的能力；应用3D视网膜类器官诱导技术获得视网膜类器官，并采用免疫荧光染色法评价VSX2蛋白与eGFP的共定位情况。
电转后通过PCR鉴定和Sanger测序成功筛选到1株含有VSX2-eGFP报告基因的hiPSC系。核型分析结果显示该报告细胞系核型正常。STR鉴定结果表明，BC1-VSX2eGFP-iPSCs无细胞系交叉污染。逆转录PCR检测和免疫荧光染色表明，BC1-VSX2eGFP-iPSCs中iPSCs标志物基因和蛋白表达阳性，包括NANOG、OCT4、SOX2、DNMT3B和GDF3 mRNA以及NANOG、OCT4、SSEA4和TRA-1-60蛋白。免疫荧光染色表明，由BC1-VSX2eGFP-iPSCs分化的三胚层组织中内胚层标志物甲胎蛋白(AFP)、中胚层标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和外胚层标志物神经细胞特异性微管蛋白(TUJ1)表达均为阳性；eGFP与VSX2共表达于视网膜类器官的神经视网膜。
成功构建1株表达VSX2-eGFP报告基因的hiPSCs，该细胞系可实时指示VSX2蛋白的时空表达变化，为视网膜发育、疾病机制研究及治疗方法评价提供有力工具。
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视网膜退行性疾病导致的不可逆盲给人类的健康和生活带来了沉重的经济和精神负担，这些疾病主要包括黄斑变性疾病和视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)等[1,2]，目前尚无有效治疗方法。人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)在体外可通过诱导分化获得各种类型的视网膜细胞，为细胞替代疗法治疗相关疾病带来了希望[3,4,5]。近年来相关研究表明，hiPSCs在特定条件下还可分化获3D视网膜类器官，可在体外模拟神经视网膜的发育过程和视网膜自然病变进程，为视网膜变性疾病干预药物的筛选和其他治疗方法的探索提供研究平台，也可为视网膜移植治疗提供丰富的种子细胞[6,7,8,9,10]。hiPSCs诱导分化获得3D视网膜类器官技术的快速发展使得人视网膜发育和视网膜疾病的体外研究成为可能，近年来成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 9，CRISPR/Cas9)等基因编辑技术的发展，以及利用基因编辑技术构建的荧光报告基因细胞系更是为视网膜类器官的活体实时观察提供了强有力的工具[11,12]。视觉系统同源框2(visual system homeobox 2，VSX2)是神经视网膜发育过程中至关重要的转录因子，为视网膜祖细胞(retinal progenitor cells，RPCs)代表性的标志物之一[13,14]。在视网膜形成早期，VSX2主要表达于RPCs中[15]，而在视网膜发育后期和成熟的视网膜中，VSX2主要表达于双极细胞[16]。对hiPSCs诱导分化为视网膜类器官过程中VSX2在不同类型视网膜细胞中的表达进行研究是关键环节之一，目前对于VSX2在视网膜细胞中的表达主要是通过动物模型进行研究[15,16,17,18,19]，但由于动物与人类之间存在明显的种属差异，且人视网膜样本难以获得，因此迄今为止VSX2在人视网膜中表达的相关研究仍存在空缺。本研究中采用CRISPR/Cas9技术构建VSX2的增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein，eGFP)报告基因hiPSCs细胞系，为视网膜发育的实时观察、相关疾病机制研究、视网膜疾病干预药物的筛选及细胞替代治疗提供工具。
