探讨昼夜节律变化对视黄酸相关孤儿受体(RORs)表达量及RORs激动剂SR1078对角膜上皮创伤修复的影响。
选取SPF级6~8周龄C57BL/6雌性小鼠228只，采用随机数表法将其中180只小鼠分为昼夜节律正常组、全昼组、全夜组、昼夜颠倒12 h组和昼夜颠倒3周组，每组36只。将剩余48只小鼠采用随机数表法随机分为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组和SR1078组，每组24只。按照分组，将小鼠置于可控制光照(光照强度300 lx)及黑暗时间的节律箱中，其中昼夜节律正常组、PBS对照组和SR1078组节律箱的光照时间为7：00~19：00，黑暗时间为19：00~次日7：00。根据Zeitgeber Time计时法，以开始光照时间7：00记为ZT0，以关闭光照时间19：00记为ZT12。采用实时荧光定量PCR法检测昼夜节律正常组、全夜组、全昼组、昼夜颠倒12 h组和昼夜颠倒3周组ZT1、ZT5、ZT9、ZT13、ZT17、ZT21各时间点RORα和RORγ mRNA相对表达量。PBS对照组和SR1078组采用高尔夫样刀建立小鼠角膜上皮损伤模型并按照分组情况用相应试剂点眼，每隔6 h给药1次。采用Adobe Photoshop CC2019软件测量角膜上皮缺损面积，计算并比较2个组角膜上皮缺损率。分析昼夜节律正常组、全昼组、全夜组、昼夜颠倒12 h组和昼夜颠倒3周组小鼠角膜上皮RORα和RORγ mRNA相对表达量与PBS对照组和SR1078组角膜上皮缺损率的相关性。采用全角膜铺片及免疫荧光染色法观察角膜上皮修复情况，计算并比较PBS对照组和SR1078组小鼠角膜上皮分裂细胞数量。
与昼夜节律正常组比较，全昼组、全夜组、昼夜颠倒12 h组和昼夜颠倒3周组小鼠RORα/RORγ mRNA相对表达量整体呈减少趋势。造模后不同时间点PBS对照组和SR1078组小鼠角膜上皮缺损率总体比较差异有统计学意义(F组别＝74.01，P<0.001；F时间＝5 171.48，P<0.001)，其中造模后12 h SR1078组角膜上皮缺损率显著低于PBS对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。角膜组织中RORα和RORγ mRNA相对表达量与小鼠角膜上皮缺损率均呈中度正相关(r＝0.614、0.537，均P<0.01)；RORα mRNA相对表达量与角膜上皮缺损率变化量的直线回归方程为Y＝33.153X-43.052(F＝20.58，P<0.001)，RORγ mRNA相对表达量与角膜上皮缺损率变化量的直线回归方程为Y＝2.764X-1.364(F＝13.11，P<0.001)。造模后不同时间点SR1078组和PBS对照组小鼠角膜上皮分裂细胞数量总体比较差异有统计学意义(F分组＝160.55，P<0.001；F时间＝83.57，P<0.001)，其中造模后24、30、36 h SR1078组分裂细胞数目显著少于PBS对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。
昼夜节律变化使小鼠角膜中RORα和RORγ mRNA表达减少，SR1078可通过促进角膜上皮RORα和RORγ mRNA的表达使小鼠角膜上皮分裂细胞数量减少，抑制角膜创伤后的修复过程。
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角膜上皮细胞通过不断更新的方式来保持角膜上皮的稳态，角膜上皮细胞更新节律异常会造成角膜上皮稳态的失衡，引起角膜上皮缺损[1]。角膜损伤的修复是一个复杂的过程，主要过程为创口区域炎症反应的触发引起炎症细胞从角膜缘周围血管渗出，清除损伤区域的坏死组织，并伴随着炎症反应的消退，使基底细胞重塑角膜基质。视黄酸相关孤儿受体(retinoic acid-related orphan receptors，RORs)由RORα、RORβ和RORγ 3个成员组成，分布在全身各个部位，在生理节律调节、新陈代谢紊乱、炎症发生以及免疫系统调节等生理病理过程中扮演重要角色。ROR基因转录具有节律性，当小鼠RORα缺失时，会扰乱生物钟基因Bmal1的调控，引起昼夜节律的异常[2]。相关研究表明，小鼠缺乏RORα/RORγ可显著降低Cry1、Bmal1、Rev-Erbα和Per2等时钟基因的活性[3]。RORs激动剂SR1078能够合成RORα/γ，提高RORα和RORγ RNA的表达活性，促使RORα/RORγ与目的基因启动子上的ROR调控元件(ROR response element，RORE)结合，刺激RORα/RORγ目的基因的表达[4]。昼夜节律是生命适应内部环境周期变化演变而来的内在计时机制，其中环境对机体的节律性改变最大的机制是光照/黑暗循环，在维持细胞活动(如激素分泌、细胞增生和细胞内代谢等)的转化及有序性和协同性方面发挥重要作用。研究表明，不同的光照条件下角膜上皮的有丝分裂能力会发生明显改变，影响角膜创伤修复的能力[5,6,7]。可见光的光子会破坏DNA和细胞膜、线粒体等细胞器，并通过产生活性氧和破坏细胞色素而影响细胞的呼吸作用[8,9]。研究发现昼夜节律对角膜的正常生长发育和角膜厚度变化具有较大影响[10]，角膜上皮的更新具有日节律性[7]，光照节律也能够引起大鼠视网膜中时钟基因的表达发生改变[11]。越来越多的证据表明，许多疾病的发生与基因突变或环境因素引起的昼夜节律改变密切相关[12]，RORα/RORγ在角膜、大脑、胸腺、肝脏和肺脏等多种组织中均有表达，目前关于RORα/RORγ的相关研究主要聚焦于各种癌症、脑部及淋巴细胞发育的研究，而RORα/RORγ对角膜影响的相关研究较少。本研究拟探讨SR1078对角膜上皮修复的动力学影响，观察不同昼夜节律下RORα/RORγ表达量的动态变化及SR1078作用下角膜创伤修复动力学以及分裂细胞的动态变化，为SR1078对角膜上皮细胞创伤修复的调控及其影响因素的研究提供新的实验依据。
