探讨CLC-2氯离子通道靶向阻滞对人结膜成纤维细胞(HConF)纤维化过程的抑制作用。
将HConF分为空白对照组、脂质体2000(Lipo2000)组、无义小干扰RNA(siRNA)组和CLC-2 siRNA转染组，其中空白对照组不做任何处理，其他各组分别采用含有相应转染试剂的培养基培养。采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞中CLC-2 mRNA的表达水平；采用CCK-8试剂盒检测各组HConF的增生能力，即吸光度(A)值；采用流式细胞仪检测各组HConF凋亡比例；采用细胞划痕实验和Transwell迁移实验检测各组HConF迁移能力；采用胶原收缩实验检测各组胶原面积收缩率；采用Western blot法检测各组细胞胶原蛋白(Collagen)Ⅰ、Collagen Ⅲ、PI3K、Akt、p-PI3K和p-Akt的蛋白表达水平。
空白对照组、Lipo2000组、无义siRNA组和CLC-2 siRNA转染组CLC-2 mRNA相对表达量和细胞A值总体比较差异均有统计学意义(F＝90.110、198.680，均P<0.001)，其中CLC-2 siRNA转染组CLC-2 mRNA相对表达量和细胞A值明显低于无义siRNA组，差异均有统计学意义(均P<0.001)。空白对照组、Lipo2000组、无义siRNA组和CLC-2 siRNA转染组细胞凋亡率分别为(4.78±1.10)%、(4.54±1.51)%、(4.82±0.88)%和(28.90±0.91)%，总体比较差异有统计学意义(F＝363.260，P<0.001)，其中CLC-2 siRNA转染组细胞凋亡率明显高于无义siRNA组，差异有统计学意义(P<0.001)。各组细胞迁移率和细胞迁移数量总体比较差异均有统计学意义(F＝74.493、1 625.431，均P<0.001)，其中CLC-2 siRNA转染组细胞迁移率明显低于无义siRNA组，细胞迁移数量明显少于无义siRNA组，差异均有统计学意义(均P<0.01)。各组细胞胶原面积收缩率总体比较差异有统计学意义(F＝104.692，P<0.001)，其中CLC-2 siRNA转染组细胞胶原面积收缩率明显低于无义siRNA组，差异有统计学意义(P<0.001)。各组Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白相对表达量及p-PI3K/PI3K比值和p-Akt/Akt比值总体比较差异均有统计学意义(F＝112.073、456.931、340.889、43.021，均P<0.001)，其中CLC-2 siRNA转染组Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白相对表达量及p-PI3K/PI3K比值和p-Akt/Akt比值明显低于无义siRNA组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。
靶向抑制CLC-2氯离子通道基因表达可通过PI3K/Akt信号通路促进HConF凋亡，抑制细胞迁移、胶原合成及胶原收缩，抑制纤维化过程。
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青光眼是由于病理性高眼压而引起视神经损害和视野缺损的眼病，是全球主要的不可逆性致盲眼病[1]。滤过性手术是目前治疗青光眼的主要手术方式，影响滤过手术成功率的主要原因是滤过区域的过度瘢痕化。尽管抗代谢药物丝裂霉素C(mitomycin C，MMC)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)的应用提高了手术成功率，但是这些药物存在一定的毒性作用和不良反应[2]。近年来，随着细胞分子生物学及基因组学等技术的不断进步，针对青光眼滤过术后抗瘢痕治疗的新技术、新方法不断涌现[3,4,5,6]。但参与瘢痕形成的细胞因子种类繁多，目前对于这些因子及其调控机制的认识尚不足，因此进一步探索滤过泡瘢痕化的机制并寻找高效低毒性的抗瘢痕方法具有重要的临床意义。氯离子通道蛋白是广泛分布于哺乳动物各组织器官的一种通道蛋白，在机体内可以维持细胞容积、膜电位和pH值的稳定[7]。近年来，关于氯离子通道参与瘢痕化过程的研究逐步深入。本课题组通过体外实验证实氯离子通道阻滞剂5-硝基-2-(3苯丙氨基)苯甲酸[5-nitro-2-(3-phenylpropylamino) benzoic acid，NPPB]可以抑制人结膜成纤维细胞(human conjunctival fibroblasts，HConF)的增生、迁移和细胞外基质合成过程[8]。Fuchigami等[9]研究发现，非洲爪蟾胚胎受伤表皮前缘局部氯离子通道蛋白CLC-3表达的增强与伤口闭合有关，提示CLC-3参与了伤口愈合过程。Pan等[10]用高糖抑制大鼠角质细胞CLC-2氯离子通道之后细胞增生和迁移能力受到抑制。但是CLC-2氯离子通道在青光眼术后滤过泡瘢痕化过程的作用尚不清楚。本研究拟通过RNA干扰的方法抑制CLC-2氯离子通道的表达，观察CLC-2氯离子通道在HConF凋亡、迁移、胶原合成和胶原收缩过程中的作用以及相关的信号传导通路，寻找抑制青光眼滤过泡瘢痕形成的新靶点。
