体外培养新生大鼠海马神经元，建立神经元氧-糖剥夺再灌注(OGD/R)模型，为临床进一步研究新生儿缺氧缺血性脑损伤奠定基础。
以L-多聚赖氨酸和鼠尾胶原作为海马神经元体外培养的生长基质，分离24 h内新生SD大鼠海马，胰蛋白酶水浴振荡消化获得单个细胞，采用Neurobasal维持培养基更继续培养。培养7 d后将神经元细胞培养基更换为无糖缺血液，置于95%高纯度氮气(N2)三气培养箱内缺氧处理2 h。将其取出更换为正常培养基继续培养24 h，构建神经元OGD/R模型。然后，采用抗微管相关蛋白2-5-异硫氰酸荧光素(anti-MAP2-FITC)标记神经元，于荧光显微镜下观察建模前与建模后神经元的形态学改变，采用细胞活性检测试剂盒(CCK-8)检测微管相关蛋白(MAP)2阳性细胞存活率，对OGD/R模型进行评价。
荧光显微镜下观察到正常情况下神经元细胞形态结构完整，树突及轴突舒展，交织成网状。建模后，神经元突触回缩，细胞崩解，网状结构被破坏。CCK-8检测结果显示，建模后神经元细胞存活率降低。
此方法体外培养神经元细胞纯度在95%以上；使用无糖神经元细胞缺血液联合高纯度N2培养2 h，再更换为正常培养基培养的方法，可成功建立神经元细胞的OGD/R模型。
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缺氧缺血性脑损伤作为一种病理过程，存在于多种神经系统疾病，如脑缺血、脑出血、脑外伤、缺氧性脑病等疾病中，伴随着神经细胞损伤，可导致神经功能永久性缺陷或缺失。如何建立一种简便的体外神经元缺氧缺血模型具有重要临床意义，目前公认神经元缺氧合并培养基缺糖模型，可模拟体内缺氧缺血性脑损伤[1]。
作为大脑边缘系统的重要组成部分，海马神经元在高级神经功能中发挥着重要作用[2,3,4]。因此，本研究选择对体外培养7 d的SD大鼠海马神经元进行氧-糖剥夺处理2 h，再联合复氧、复糖24 h，制造氧-糖剥夺再灌注(oxygen-glucose deprived and reperfusion，OGD/R)模型。建立良好的海马神经元OGD/R模型，是对海马相关神经系统疾病进行细胞分子水平研究的基础。现将研究结果报道如下。
选择出生24 h内健康新生SD大鼠6只(雌、雄不限)为研究对象。由四川大学华西实验动物中心提供(许可证号：2004A067)，健康新生SD大鼠纳入标准为清洁级，雌、雄不限。实验过程对动物的处置符合动物伦理学要求。
DMEM基础培养基(批号：C11995500BT，美国Gibco公司)。Neurobasal培养基(批号：10888022，美国Gibco公司)。L-谷氨酰胺、胰蛋白酶、新生胎牛血清、多聚赖氨酸、鼠尾胶原(批号：G8540、T7409、F2442、P2636、C7661，美国Sigma公司)。细胞活性检测试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)(批号：CM804，日本同仁化学研究所)。小鼠抗微管相关蛋白2单克隆抗体(anti-microtubule-associated protein 2，anti-MAP2)(批号：YY-KB-1934，美国Abcam公司)。5-异硫氰酸荧光素(fluorescein-5-isothiocyanate，FITC)标记荧光二抗(批号：ZF-0315，北京中杉公司)，4'，6二脒基-2-苯吲哚盐酸(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(批号：D9564，美国Sigma公司)。超净工作台(日本Airtech公司)，微量加样器(德国Eppendorf公司)，酶标仪(美国Bio-Rad公司)，解剖显微镜(日本Olympus公司)，CO2培养箱(美国Thermo公司)，三气培养箱(美国Thermo公司)，恒温水浴箱(美国Memmert公司)，尼康全自动倒置镜像工作站(日本Nikon TiE公司)，70 μm筛网(美国Mi11ipore公司)，6孔及96孔聚乙烯培养板(美国Millipore公司)，NIS-Elements AR 3.00，SP7 (Build 547)图像分析软件(日本Nikon TiE公司)。医用CO2、高纯度氮气(N2)均由本院供气中心提供。
采用双蒸水清洗涤直径为0.5 cm的盖玻片，烘干浸泡于高浓度H2SO4溶液中过夜，再采用双蒸水多次反复振荡、清洗，烘干后，高压灭菌后再烘干备用。参考韩璐等[5]研究中操作方法，对于经过上述处理的盖玻片，于使用前置于6孔聚乙烯培养板内，在有盖玻片或无盖玻片的培养板内加入由17 mmol/L醋酸、0.3 g/L右旋多聚赖氨酸、0.06 g/L鼠尾胶原组成的包被液，作为细胞生长支持物，于37 ℃孵育40 min后吸去包被液，采用三蒸水洗去残留包被液，于超净工作台吹干后置于CO2培养箱中保存备用。
取出生24 h内新生SD大鼠6只，采用75%酒精消毒后，断头取脑置于预先冰浴处理的Hank's平衡盐溶液(Hank's balanced salt solution，HBSS)中。于显微镜下分离6只新生SD大鼠的双侧海马，剔除软脑膜及血管，加入0.125%胰蛋白酶后，37 ℃水浴振荡消化10～15 min，吸去胰蛋白酶，采用HBSS洗涤2次后，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基吹打成细胞悬液。通过70 μm筛网过滤后，采用培养液调整细胞悬液的细胞密度为1×106/mL，种植于上述处理好的盖玻片上，接种于含10%胎牛血清、1%丙酮酸钠、1% GlutaMax高糖DMEM培养基，共12份。待其贴壁4 h后，更换为维持培养基继续培养，维持培养基为含2% B27与1% GlutaMax的Neurobasal培养基。以后每3 d更换50%培养液。培养7 d后取盖玻片，进行神经元细胞纯度鉴定。
随机选择上述培养的3只新生SD大鼠6份海马神经元细胞，采用微管相关蛋白2(microtubule-associated protein，MAP2)进行免疫荧光鉴定。具体方法参考郭慧等[6]既往的研究：取体外培养7 d的新生SD大鼠海马神经元细胞，采用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗新生海马神经元细胞2次后，采用4%多聚甲醛于4 ℃条件下固定20 min，采用PBS冲洗5 min×3次，采用0.1%聚乙二醇对异辛基苯基醚(TritonX-100)于4 ℃条件下打孔15 min，再采用PBS冲洗5 min×3次，5%羊血清封闭30 min，滴加一抗标记。对经上述处理的新生SD大鼠海马神经元细胞采用小鼠anti-MAP2，工作稀释度为1∶200，置于湿盒(协力塑料制品厂)中4 ℃条件下孵育过夜，次日采用PBS冲洗5 min×3次后，滴加FITC标记的抗小鼠二抗，工作稀释度为1∶200，室温孵育2 h，PBS冲洗5 min×3次，采用DAPI对预处理的新生大鼠海马神经元细胞进行细胞核染色5 min，采用PBS充分洗涤后，再采用抗荧光淬灭封片剂和指甲油封片。最后，在荧光显微镜下检测3只新生SD大鼠6份海马神经元细胞MAP2阳性表达细胞数所占总细胞数的比例，即为神经元细胞纯度。
MAP2是神经元细胞核内的特异性抗原。在荧光显微镜下，可见MAP2在神经元细胞体和树突中表达，以此作为判断原代海马神经元细胞体外培养成功的标准[7]。在上述处理的3只新生SD大鼠6份原代培养神经元细胞中，采用anti-MAP2-FITC免疫荧光染色方法，经NIS-Elements AR 3.00, SP7 (Build 547)图像分析软件分析，于荧光显微镜下计数10个视野下的100个细胞中MAP2阳性表达海马神经元细胞所占比例，取平均值，即为新生大鼠海马神经元细胞纯度。
对上述处理的3只新生SD大鼠6份体外培养7 d的海马神经元细胞，采用37 ℃预热的PBS清洗细胞3次，加入神经元缺血液。神经元缺血液制备：无糖DMEM基础培养基1.66 g，NaHCO3 0.068 g，谷氨酰胺0.117 g，Hepes 0.476 g溶于双蒸水200 mL中，调节pH值为7.3左右，滤器过滤后置于4 ℃冰箱待用。然后，将3只新生SD大鼠6份海马神经元细胞放置于三气培养箱，控制温度为37 ℃，缺氧条件为95% N2与5% CO2。放置2 h后，取出培养的神经元细胞，加入正常神经元培养液继续培养24 h后收取细胞，构建海马神经元OGD/R模型。
采用CCK-8检测OGD/R建模对神经元细胞存活率的影响。具体方法如下：对3只新生SD大鼠6份体外培养7 d的海马神经元细胞，采用血球计数板镜下计数，调整神经元细胞悬液密度为(2～4)×104/mL，分别以100 μL/孔接种于96孔板中；复氧24 h后，再按照1∶9的体积比加入CCK-8工作液，纳入OGD/R组，采用酶标仪比色于450 nm处检测OGD/R组的吸光度(absorption，A)值。将只加有CCK-8工作液而无海马神经元细胞的孔设为空白对照组，于37 ℃ CO2培养箱中孵育1.5 h，采用酶标仪比色于450 nm处检测空白对照组的A值。另外未进行OGD/R处理的3只新生SD大鼠6份体外培养7 d的原代海马神经元细胞，采用血球计数板镜下计数，调整原代神经元细胞悬液的密度为(2～4)×104/mL，分别以100 μL/孔接种于96孔板中，再按照1∶9的体积比加入CCK-8工作液，纳入正常对照组。设定正常对照组海马神经元细胞A值为1，海马神经元细胞生存率为100%。OGD/R组海马神经元细胞生存率＝(OGD/R组A值－空白对照组A值)/(正常对照组A值－空白对照组A值)×100%。同时，采用免疫荧光染色法观察OGD/R模型建模前与建模后海马神经元形态改变，并评价OGD/R模型是否成功建立。
本研究数据采用SPSS 17.0统计学软件进行处理，本研究统计检验的最小样本量估算采用Ssize软件。对呈正态分布的计量资料采用
±s表示，组间比较采用t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。
新生SD大鼠海马神经元细胞在体外培养30 min时，大部分细胞开始贴壁，呈圆形或椭圆形，体积小，单个均匀分布；培养2 h后，细胞贴壁明显，少数细胞开始长出突起；3 d后神经元细胞体增大，突起延长。新生大鼠神经元细胞体外培养至第7天时，神经元分化成熟，细胞质丰富，树突及轴突舒展延长，见图1。对3只新生SD大鼠6份体外培养7 d的大鼠海马神经元细胞采用anti-MAP2-FITC免疫荧光染色方法，经NIS-Elements AR 3.00, SP7 (Build 547)图像分析软件分析10个视野下的100个细胞，神经元细胞纯度为96.3%，且细胞生长状况良好，形态优美，神经纤维交织成网状，见图2。
注：anti-MAP2-FITC：抗微管相关蛋白2单克隆抗体-5-异硫氰酸荧光素(anti-microtubule-associated protein 2-fluorescein-5-isothiocyanate)；DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole)；OGD/R：缺氧缺血再灌注(oxygen-glucose deprived and reperfusion)
采用CCK-8测定OGD/R建模对神经元细胞活性的影响结果显示，OGD/R可对神经元细胞造成损伤，降低海马神经元细胞活性，见表1。采用anti-MAP2-FITC免疫荧光法于荧光显微镜下观察OGD/R建模前与建模后神经元形态改变可见，OGD/R建模后，神经元突触回缩，神经纤维网状结构崩解，见图3。
采用CCK-8测定OGD/R建模对海马神经元细胞生存率的影响
采用CCK-8测定OGD/R建模对海马神经元细胞生存率的影响
| 组别 | 鼠数(只) | 海马神经元细胞生存率(%) | t值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| OGD/R组 | 3 | 25.2±4.0 | 9.6 | <0.05 |
| 正常对照组 | 3 | 100.0 |
注：CCK-8：细胞活性检测试剂盒(cell counting kit-8)；OGD/R：缺氧缺血再灌注(oxygen-glucose deprived and reperfusion)
细胞体外培养因其培养环境可控、给药方式简便、作用直接，已成为研究人体各系统疾病的重要手段。海马是中枢神经系统神经形成的特殊结构，研究证明，海马结构早期变化参与阿尔茨海默病、海马硬化症、痴呆等相关神经元退行性疾病的病理、生理过程[8]。同时，海马还是脑组织中对缺氧最敏感的区域，因此，原代培养海马神经元适用于新生儿缺血性脑损伤模型的建立及研究。MAP2属于结构性MAP家族，特异性表达于神经元的细胞体、树突和轴突，而在星形胶质细胞及少突胶质细胞中不表达，是目前公认的神经元特异性标志物[7]。
本研究以L-多聚赖氨酸和鼠尾胶原作为神经元体外培养的生长基质，分离出生24 h内新生SD大鼠海马，运用单一胰蛋白酶水浴振荡消化后，吹打成细胞悬液，将其以适当密度种植于含10%胎牛血清DMEM培养基中培养，贴壁4 h后，换为Neurobasal维持培养基继续培养，以后每3 d更换50%培养液。采用anti-MAP2-FITC免疫荧光法对所获细胞进行鉴定。通过上述方法获得的海马神经元细胞生长状态良好，并且具有较高纯度，为进一步进行海马神经元缺氧模型的研究创造条件。
目前实验室使用的缺氧模型主要有以下3种。①物理缺氧法：因气体成分不同分为2种，即95% N2/5% CO2[9]或85% N2/5% CO2/10% H2[10]；②化学缺氧法：联合使用呼吸链抑制剂二氯化钴(CoCl2)及抗霉素A(antimycin A)[11]；③物理缺氧及化学缺氧的联合使用：氧-糖剥夺模型是在细胞水平上模拟缺血、低氧的刺激模型[12,13]。与第一种物理缺氧法相比，氧-糖剥夺模型可更全面反映脑缺氧、缺血时细胞状态；与单纯化学缺氧法相比，氧-糖剥夺模型可有效避免缺氧剂对神经元的毒性作用。另外，在实验中三气培养箱的运用，不仅可对无糖神经元缺氧液预先进行去氧处理，使神经元迅速达到缺氧状态，还可精确控制缺氧气体成分，保证缺氧效果[14]。新生儿缺氧缺血性脑损伤与成年人的不一样，在损伤发生后有自发性溶栓现象，可造成再灌注损伤[15]。本研究选择体外培养7 d的大鼠海马神经元细胞，将正常的神经元培养基更换为无糖缺血液，再将神经元细胞置于三气培养箱内，在37 ℃含95% N2、5% CO2混合气体的环境下缺氧处理2 h，取出后更换为正常神经元培养基，置于含O2的正常培养箱中培养24 h，构建神经元OGD/R模型，采用anti-MAP2-FITC标记神经元，CCK-8检测细胞存活率，荧光显微镜下观察建模前与建模后神经元的形态学改变，对OGD/R模型进行评价。荧光显微镜下观察到正常情况下神经元细胞形态结构完整，树突及轴突舒展，交织成网状。新生大鼠海马神经元OGD/R模型建模后，神经元突触回缩，细胞崩解，网状结构被破坏。CCK-8检测结果显示，建模后神经元细胞存活率降低。结果表明，使用无糖神经元细胞缺血液联合三气培养箱中高纯度N2培养2 h的方法，可成功建立神经元细胞的OGD/R模型。
综上所述，本研究以Neurobasal培养基为神经元基础培养基，加以B27及GlutaMax培育出纯度为96.3%的海马神经元细胞，在此基础上使用无糖神经元细胞缺血液联合三气培养箱构建了一种稳定的海马神经元OGD/R模型。该海马神经元OGD/R模型的建立为进一步研究海马神经元的结构和功能，提供了可靠的实验基础，为临床进一步研究新生儿缺血缺氧性脑损伤奠定了基础。
