探讨妊娠期糖尿病(GDM)母亲分娩新生儿与健康足月新生儿脐血血清S100B蛋白、caspase-3蛋白含量变化及其与新生儿行为神经测定(NBNA)评分的关系，并分析S100B蛋白、caspase-3蛋白含量与GDM母亲分娩新生儿脑损伤的关系。
选择2015年1月至2016年3月于连云港市第一人民医院产科分娩的86例足月新生儿为研究对象。根据母亲孕期是否合并GDM，将其分为GDM组(n＝33)和对照组(n＝53)。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定2组新生儿脐血血清S100B蛋白、caspase-3蛋白含量，并于生后第3天对新生儿进行NBNA评分。
①2组新生儿性别构成比、胎龄、出生体重、母亲年龄等一般临床资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。② GDM组新生儿脐血血清S100B蛋白、caspase-3蛋白含量均高于对照组[(38.8±9.3) pg/mL vs (12.4±2.6) pg/mL，(5.3±1.7) μg/mL vs (2.8±0.6) μg/mL]，并且差异均有统计学意义(t＝8.314、15.977，P<0.001)。GDM组NBNA评分低于对照组[(36.3±1.2) 分 vs (38.3±1.2)分]，并且差异亦有统计学意义(t＝8.129，P<0.001)。③GDM组中，新生儿脐血血清S100B蛋白、caspase-3蛋白含量与NBNA评分呈负相关关系(r＝－0.583、－0.814，P<0.001)，新生儿脐血血清S100B蛋白含量与caspase-3蛋白含量呈正相关关系(r＝0.394，P＝0.023)。对照组中，新生儿脐血血清S100B蛋白、caspase-3蛋白含量与NBNA评分，均无相关性(P>0.05)。
GDM母亲分娩新生儿可能存在脑损伤，新生儿脐血血清S100B蛋白和caspase-3蛋白可作为预判GDM母亲分娩新生儿脑损伤及其程度的指标。
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妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是妊娠期首次发现或发生的不同程度糖代谢异常。如果晚孕期母体胰岛素储备功能仅为临界状态，无法满足晚孕期的需求，则母体体内组织胰岛素相对缺乏，且对胰岛素的需求随孕周增加而有所下降，最终导致血糖值升高，引起GDM。GDM可对新生儿造成诸多不良影响，如巨大儿、红细胞增多、低血糖、呼吸窘迫综合征、发育异常等，尤其是对神经系统影响较大，远期影响可至成年[1]。近年来，我国GDM发生率呈逐年升高的趋势，GDM对新生儿的影响日益受到重视。目前，对GDM母亲分娩新生儿神经系统情况的相关研究较少，对神经系统影响程度的判断以及预后的评估，暂无明确标准。血清星形胶质源性蛋白(S100B蛋白)为脑特异性蛋白，主要集中于中枢神经系统神经胶质细胞及施万细胞(Schwann cell)，对神经系统损伤高度敏感。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine-aspartic protease，caspase)-3是对底物天门氨酸部位有特异性水解作用，且在活性中心富含半胱氨酸的一个半胱氨酸蛋白酶，是细胞凋亡的标志酶。本实验通过测定GDM母亲分娩的新生儿的脐血血清中S100B蛋白、caspase-3蛋白含量和生后3 d对新生儿进行新生儿神经行为测定(neonatal behavioral neurological assessment，NBNA)，探讨脐血血清S100B蛋白、caspase-3蛋白分别与NBNA评分的相关性，早期预判GDM母亲分娩新生儿是否存在脑损伤及其损伤程度。现将研究结果报道如下。
选择2015年1月至2016年3月，在连云港市第一人民医院出生的86例足月新生儿为研究对象。本研究纳入标准：①母亲分娩时年龄为20～40岁；②自然妊娠；③单胎妊娠。排除标准：①产前检查排除糖尿病合并妊娠、严重基础疾病、其他妊娠并发症及不良生育史者；②宫内感染、宫内呼吸窘迫及围生期窒息者；③胎盘早剥、胎盘老化者；④胎儿发育不良者；⑤新生儿罹患先天性遗传代谢疾病、严重先天性心脏病、贫血、低血糖等。按照新生儿的母亲孕期是否伴有GDM，将其分为GDM组(n＝33)和对照组(n＝53)。
参照《2014年妊娠合并糖尿病诊治推荐指南》[2] 中制定的GDM诊断标准。本研究纳入的所有孕妇于孕龄为24～28孕周采用75 g葡萄糖负荷进行口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test，OGTT)检查。75 g OGTT的诊断界值如下：空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)值≥5.1 mmol/L(92 mg/dL)，或1 h血糖值≥10.0 mmol/L(180 mg/dL)，或2 h血糖值≥8.5 mmol/L(153 mg/dL)，任何一时间点血糖值达到或超过上述标准即可诊断为GDM。
胎儿娩出后即刻抽取脐静脉血5 mL，放入干燥不含抗凝剂的试管中，室温(22～24 ℃)下于30 min内，以3 000 r/min离心5 min后分离血清，置于－20 ℃冰箱保存待测。检测时将冷藏标本预温至20 ℃，环境温度为20～25 ℃。
应用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuosorbent assay，ELISA)测定脐血血清S100B蛋白和caspase-3蛋白含量。脐血血清S100B蛋白、caspase-3蛋白的ELISA试剂盒(批号分别为1512261、1601181，上海西唐生物科技有限公司提供)。
2组新生儿均于生后第3天由2名本院儿童保健科医师进行NBNA评分。NBNA评分包括新生儿的行为能力、被动肌张力、主动肌张力、原始反射、一般反应共计5项测试，测试要求在室温为24～28 ℃的光线半暗、安静的环境中进行，测试前先将新生儿置于上述环境中30 min待其适应环境后，在喂奶间隙的睡眠状态中开始，全部检查于10 min内完成。检查工具：手电筒1个、长方形红色塑料盒1个，红球(直径为6～8 cm)1个，秒表1个。NBNA评分标准：≥37分为正常，35～36分提示可疑脑损伤，<35分则提示脑损伤。
采用Ssize软件，确定满足本研究统计检验的最小样本量。本研究采用SPSS 18.0统计学软件对所得数据进行统计学处理。首先对计量资料进行分布状态分析，对呈正态分布、方差齐性的计量资料，如胎龄、出生体重等指标，采用
±s表示，并进行单因素方差分析。对呈正态分布的计量资料，如S100B蛋白、caspase-3蛋白含量及NBNA评分等指标，采用
±s表示，组间比较采用t检验。2组新生儿的性别构成比等计数资料，采用率(%)表示，组间比较采用χ2检验。2组新生儿脐血血清S100B蛋白、caspase-3蛋白含量和NBNA评分的相关性分析采用直线相关分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。
2组新生儿性别构成比、胎龄、出生体重、母亲年龄等一般临床资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。2组新生儿一般临床资料比较，见表1。
2组新生儿一般临床资料比较
2组新生儿一般临床资料比较
| 组别 | 例数 | 性别[例数(%)] | 胎龄 (周， ±s) | 出生体重 (g， ±s) | 母亲年龄 (岁， ±s) | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 男 | 女 | |||||
| GDM组 | 33 | 18(54.5) | 15(45.5) | 38.3±0.9 | 3 779±640 | 32.1±5.2 |
| 对照组 | 53 | 29(54.7) | 24(45.3) | 39.6±1.0 | 3 447±352 | 31.8±3.9 |
| 检验值 | χ2＝1.253 | F＝1.133 | F＝1.125 | F＝0.767 | ||
| P值 | 0.305 | 0.195 | 0.181 | 0.381 | ||
注：GDM为妊娠期糖尿病
GDM组新生儿脐血血清S100B蛋白、caspase-3蛋白含量均高于对照组，并且差异均有统计学意义(P<0.001)。GDM组新生儿NBNA评分显著低于对照组，差异亦有统计学意义(P<0.001)。2组新生儿脐血血清S100B蛋白、caspase-3蛋白含量及NBNA评分比较，见表2。
2组新生儿脐血血清S100B蛋白、caspase-3蛋白含量及NBNA评分比较(
±s)
2组新生儿脐血血清S100B蛋白、caspase-3蛋白含量及NBNA评分比较(±s)
| 组别 | 例数 | caspase-3蛋白含量(μg/mL) | S100B蛋白含量(pg/mL) | NBNA评分(分) |
|---|---|---|---|---|
| GDM组 | 33 | 5.3±1.7 | 38.8±9.3 | 36.3±1.2 |
| 对照组 | 53 | 2.8±0.6 | 12.4±2.6 | 38.3±1.2 |
| t值 | 8.314 | 15.977 | 8.129 | |
| P值 | <0.001 | <0.001 | <0.001 |
注：GDM为妊娠期糖尿病，caspase-3为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3，NBNA为新生儿神经行为测定
GDM组中，脐血血清S100B蛋白含量与NBNA评分呈负相关关系(r＝－0.583，P<0.001)，脐血血清caspase-3蛋白含量与NBNA评分呈负相关关系(r＝－0.814，P<0.001)，S100B蛋白含量与caspase-3蛋白含量呈正相关关系(r＝0.394，P＝0.023)。
对照组中，脐血血清S100B蛋白含量与NBNA评分无相关性(r＝－0.181，P＝0.195)，脐血血清caspase-3蛋白含量与NBNA评分无相关性(r＝－0.144，P＝0.305)，脐血血清S100B蛋白含量与脐血血清caspase-3蛋白含量亦无相关性(r＝0.079，P＝0.575)。
S100B蛋白是一组低分子酸性钙结合蛋白，由α和β亚基组成，其基因定位于染色体21q22.3[3]。1965年，Savard等[4]在牛脑组织中发现，S100B蛋白主要存在于中枢神经系统的星形胶质细胞施万细胞和树突状细胞等[5]。健康新生儿的血液及脑脊液中S100B蛋白的蛋白含量低，但在病理状态下，如神经炎症、脑出血以及新生儿缺氧等，S100B蛋白会大量释放到细胞外，进入脑脊液，并通过受损的血-脑屏障进入血液，血清中S100B蛋白含量迅速升高[6]。陈珊等[7]研究结果发现，脑损伤患儿发生影像学改变前，血清S100B蛋白含量即可出现大幅升高，故血清S100B蛋白含量可作为脑损伤的早期预测指标。本研究结果显示，GDM母亲分娩新生儿的脐血血清S100B蛋白含量较母亲不伴GDM者所分娩新生儿的脐血血清明显升高，并且差异有统计学意义(P<0.001)，这提示新生儿可能存在脑损伤。
Caspase-3蛋白由N端结构域及大、小亚基组成，包含277个氨基酸。正常状况下，细胞质中caspase-3以无活性的procaspase-3形式存在。当细胞进入凋亡程序时，caspase-3被激活并诱导细胞凋亡。caspase-3既能接受凋亡信号成为凋亡的执行者，又是凋亡效应器，是凋亡发生的标志酶[8]。脑细胞死亡有2种形式，即坏死和凋亡，轻度脑损伤以神经细胞凋亡为主要表达形式。目前已经有研究结果证实，caspase介导的神经细胞凋亡机制在不同类型神经细胞中高度保守[9,10]。对宫内缺氧小鼠模型的研究结果显示，大脑皮质中caspase-3的阳性细胞数量增多，脑组织经HE染色可见神经元细胞损伤改变[11]。杜雪平和李天慧[12]研究结果表明，缺氧脑损伤后血清caspase-3含量升高越明显，脑损伤程度越严重。本研究结果显示，GDM母亲分娩新生儿的脐血血清caspase-3蛋白含量较母亲不伴GDM者明显升高，并且差异有统计学意义(P<0.001)，这提示GDM母亲所分娩的新生儿可能存在脑细胞凋亡程度增加。
NBNA评分是一种综合性行为神经检查方法，能对新生儿的行为能力、各种神经反射及状态进行全面评价，可用于早期发现新生儿脑损伤[13,14]。陈丽琼和沈剑[15]对GDM母亲分娩新生儿的神经行为进行NBNA评分 ，并进行Meta分析，结果显示GDM母亲分娩新生儿存在大脑皮层功能障碍，提示脑损伤。本研究结果亦证实，GDM母亲分娩新生儿存在神经行为改变。
本研究结果显示，GDM母亲分娩新生儿的脐血血清S100B蛋白含量和caspase-3蛋白含量较健康新生儿均显著升高，而NBNA评分较正常组低，提示GDM母亲分娩新生儿可能存在脑损伤，并且脐血血清S100B蛋白及caspase-3蛋白含量越高，NBNA评分越低，脑损伤程度越严重。罗淑静和杨慧霞[16]通过动物实验研究结果表明，GDM孕鼠的子鼠存在神经细胞数量减少及胶质细胞增生，严重者可见神经细胞周围呈大空泡样变，细胞变形，或者仅见细胞残骸，同时可见胶质细胞疤痕形成，这提示GDM孕鼠的子鼠存在脑损伤。Perna等[17]进行的临床研究结果表明，GDM母亲分娩新生儿有慢性宫内缺血缺氧并可以导致新生儿脑损伤。存在脑损伤新生儿的脑电图和健康足月儿有明显区别[18]，并且其颅脑超声检查结果可见脑部血流紊乱[19]。上述研究结果均证实，GDM母亲分娩新生儿存在脑损伤。导致脑损伤的原因较多，感染、外伤、缺氧、中毒等均可导致脑损伤，而GDM母亲分娩新生儿的脑损伤原因可能和宫内慢性缺氧有关[17,18,19,20]，而慢性缺氧可以通过产前检测羊水中红细胞生成素浓度以明确。对于胎儿宫内慢性缺氧，可能的机制为：①GDM孕妇糖尿病严重时胎盘氧化应激增加，胎盘滋养细胞和血管内皮细胞凋亡增加[21,22,23,24]，胎盘血管痉挛、硬化、狭窄，绒毛间血流灌注不足，均可导致胎儿宫内缺血缺氧[25]。②GDM孕妇高血糖导致红细胞携氧能力下降，红细胞穿过胎盘屏障的能力下降，从而降低了胎盘对胎儿血氧供应[26]；③GDM孕妇高血糖可导致胎儿高血糖和高胰岛素血症，使胎儿代谢率增加和耗氧增加，进一步加重胎儿宫内缺氧[26]。由于大脑对缺血缺氧的反应更为敏感，宫内可能出现慢性脑损伤并延续至生后。
综上所述，脐血血清S100B蛋白、caspase-3蛋白在GDM母亲分娩的新生儿中明显升高，提示GDM孕妇分娩新生儿可出现宫内慢性缺氧并导致新生儿脑损伤。因此，脐血血清S100B蛋白、caspase-3蛋白均可以作为GDM母亲分娩新生儿是否存在脑损伤的分子生物学诊断指标，对新生儿脑损伤的早期诊断、病情评估以及判断预后具有一定价值。但本研究只是横断面研究，缺乏动态观察和远期随访，新生儿脑损伤程度及预后的评价仍有待大样本、多中心的研究进一步证实。
