评价异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）的疗效。
回顾性分析2007年12月至2015年2月间接受allo-HSCT治疗的18例PNH患者临床资料，其中原发PNH 4例，再生障碍性贫血-PNH综合征（AA-PNH）14例。9例为单倍体相同供者移植（其中1例为双份脐血植入失败后行挽救性单倍体相同供者移植），7例为HLA相合同胞供者移植，2例为HLA相合无关供者移植。13例患者接受改良白消安/环磷酰胺方案为主的清髓性预处理，5例接受非清髓性预处理（氟达拉滨+抗胸腺细胞球蛋白+环磷酰胺或白消安方案）。移植物抗宿主病（GVHD）预防：同胞供者移植为环孢素联合短程甲氨蝶呤，单倍体相同供者及无关供者移植为环孢素或他克莫司、霉酚酸酯联合短程甲氨蝶呤。
所有患者均获造血重建（其中1例患者脐血植入失败后行单倍体相同供者移植）。中性粒细胞绝对计数≥0.5×109/L的中位时间为移植后11（10~26）d，PLT恢复至≥20×109/L的中位时间为移植后15（11~120）d。3例（17.6%）患者发生急性GVHD（aGVHD），其中Ⅱ度2例，Ⅳ度1例。2例（12.5%）发生局限型慢性GVHD（cGVHD）。中位随访14.6（2.0～86.7）个月，18例患者中死亡3例（17.6%），死因分别为重度aGVHD、肺部重症感染、肺部感染合并移植相关血栓性微血管病。预期5年无病生存率为（80.5±10.2）%。无复发病例。
allo-HSCT治疗PNH疗效确切，预后良好，在抗补体C5单抗尚未广泛应用的情况下，可作为有价值的治疗手段。
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阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）是一种少见的血液病，其发病源于携带PIG-A基因突变的异常造血干细胞的克隆性增殖。可表现为原发或在获得性再生障碍性贫血（AA）的背景下发病（AA-PNH综合征）。人源化的抗补体C5的单克隆抗体药物Eculizumab虽可高效控制血管内溶血，但并不能清除异常的PNH克隆，且获取困难，难以在临床广泛使用。allo-HSCT治疗PNH的优势在于其潜在的治愈效应，但对移植相关死亡（TRM）的不确定，部分限制了其在PNH中的应用。为评价allo-HSCT治疗PNH的疗效及影响因素，我们回顾性分析了2007年12月至2015年2月间在我院接受allo-HSCT治疗的18例PNH患者临床资料，报告如下。
PNH患者18例，其中男12例，女6例，中位年龄29（13～54）岁。诊断至移植的中位时间为36（2～240）个月。18例患者中原发PNH 4例，AA-PNH综合征14例。所有患者均以血管内溶血为主要临床表现，酸化血清溶血试验、糖水试验、蛇毒因子溶血试验及尿含铁血黄素等试验两项以上阳性，并经荧光标记的嗜水气单胞菌溶素变异体（FLAER）流式细胞术检测外周血CD59/CD55阴性红细胞、粒细胞、单核细胞均>10%，符合PNH的诊断标准[1]。原发PNH患者移植前曾给予糖皮质激素及成分输血治疗，AA-PNH患者曾接受环孢素（CsA）、雄激素、细胞生长因子及成分输血等治疗。移植前所有患者均存在输血依赖，移植前检测血清铁蛋白（SF）中位数为926.8（9.9~1 650.0）μg/L，铁过载患者移植前均接受祛铁治疗。
依据本中心常规供者选择顺序（HLA相合同胞供者、HLA相合无关供者、HLA单倍体相同供者或脐血）确定干细胞供者。7例为HLA同胞相合供者，2例为HLA相合无关供者，9例为HLA单倍体相同供者，其中同胞单倍体供者3例，父亲、母亲供者各2例，儿子、女儿供者各1例（女儿供者为1例双份脐血植入失败后的二次移植供者）。供受者ABO血型相合10例，主要不合4例，次要不合3例，主次要均不合1例。
14例为骨髓联合外周血干细胞移植物，2例为骨髓移植物（来自HLA相合同胞供者），2例为外周血干细胞移植物（来自无关供者），1例次为双份脐血移植物。
骨髓及外周血干细胞的采集均按我中心常规方案[2]进行。18例移植患者回输移植物单个核细胞（MNC）中位数为8.48（3.86~19.76）×108/kg，回输CD34+细胞中位数为4.14（1.97~6.57）×106/kg。骨髓联合外周血干细胞移植、骨髓移植和外周血干细胞移植三组患者回输的MNC中位数分别为9.75（5.39~19.76）×108/kg、5.53（4.43~6.63）×108/kg和6.27（3.86~8.68）×108/kg，回输CD34+细胞中位数分别为4.14（1.97~6.57）×106/kg、3.69（3.07~4.30）×106/kg和4.41（3.80~5.02）×106/kg。
13例患者接受改良BU/CY方案为主的清髓性预处理，改良BU/CY方案为白消安（BU）3.2 mg·kg-1·d-1×3 d，环磷酰胺（CY）1.8 g·m-2·d-1×2 d。同胞相合供者移植为改良BU/CY方案，单倍体相同供者及无关供者移植，在改良BU/CY方案基础上加用兔抗人胸腺细胞球蛋白（ATG）2.5 mg·kg-1·d-1×4 d。4例患者接受非清髓性预处理，均为同胞相合供者移植。具体方案：氟达拉滨（Flu）30 mg·kg-1·d-1×5 d，ATG 2.5 mg·kg-1·d-1×4 d，CY 50 mg·kg-1·d-1×2 d，或BU 3.2 mg·kg-1·d-1×2 d。1例二次移植患者，双份脐血移植前预处理为改良BU/CY方案，在挽救性单倍体相同供者移植时采取减量全身照射（TBI）+CY+ATG方案预处理。
7例同胞相合供者移植采用CsA联合短程甲氨蝶呤（MTX）的二联预防方案，另11例（均为单倍体相同及无关供者移植）采用CsA或他克莫司（FK506）+短程MTX+霉酚酸酯（MMF）的三联预防方案。CsA 3 mg·kg-1·d-1，FK506 0.03 mg·kg-1·d-1，持续24 h静脉滴注，定期检测血药浓度，使CsA浓度维持在200～300 μg/L，FK506浓度维持在10~15 μg/L，二联预防方案中CsA或FK506自-1 d开始用药，三联方案自-9 d开始用药，均在胃肠道功能正常时改为口服。短程MTX：15 mg/m2，+1 d；10 mg/m2，+3、+6、 +11 d。MMF 15 mg·kg-1·12 h-1，-9 d开始服用，至+30 d减量，+60~+90 d停用。CsA及FK506疗程根据GVHD和移植类型等情况进行个体化调整。
外周血中性粒细胞绝对计数（ANC）持续3 d>0.5×109/L，无血小板输注情况下PLT持续7 d>20×109/L，分别判定为粒细胞和血小板植活，其首日分别为粒细胞和血小板植入时间。采用DNA短串联重复序列（STR）、性染色体荧光原位杂交（FISH）、血型检测等作为植入指标。
-9 d开始给予更昔洛韦预防巨细胞病毒（CMV）感染（5 mg·kg-1·d-1）至-1 d。移植后每周检测外周血CMV-PP65抗原及CMV-DNA拷贝量，阳性者给予更昔洛韦或膦甲酸钠系统治疗。移植期间常规应用复方磺胺甲
唑预防肺孢子虫感染，氟康唑或米卡芬净预防真菌感染。低剂量肝素持续滴注联合前列腺素E1预防肝静脉闭塞病（VOD）至+30 d。输注的血制品均以30 Gy60Co辐照处理。
采用SPSS19.0软件进行统计学分析，包括t检验、单因素方差分析、非参数检验、χ2检验及Kaplan-Meier生存曲线分析。P<0.05为差异有统计学意义。
18例PNH患者移植相关临床资料见表1。例11首次移植为双份脐血移植物，为HLA 5/6相合（HLA-A、B、DR），总有核细胞数（TNC）为5.70×107/kg，ABO血型为B及A型。二次移植为女儿单倍体相同供者，移植物MNC为8.20×108/kg，CD34+细胞为4.67×106/kg，血型为AB型。诊断至移植时间≥36个月的患者，其SF水平高于时间<36个月的患者[（1 194.01±656.84）μg/L对（543.05±530.50）μg/L，P=0.040]。除例11首次的双份脐血移植物外，18例患者的不同移植物来源，即骨髓联合外周血干细胞、骨髓及外周血干细胞，三者在MNC及CD34+细胞计数上差异均无统计学意义（单因素方差分析，P=0.125）。
18例阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）/患者临床资料
18例阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）/患者临床资料
| 例号 | 性别 | 年龄（岁） | 诊断 | 诊断至移植时间（月） | 移植前SF(μg/L) | 供者及移植物类型 | 供/受者血型 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 男 | 24 | AA-PNH | 24 | 868.8 | 无关PBSC | B/O |
| 2 | 女 | 48 | AA-PNH | 240 | 1513.4 | 同胞BM+PBSC | AB/B |
| 3 | 男 | 21 | AA-PNH | 72 | 1384.0 | 父亲BM+PBSC | B/O |
| 4 | 男 | 41 | PNH | 144 | 288.9 | 同胞BM | AB/AB |
| 5 | 男 | 54 | AA-PNH | 84 | 1403.0 | 儿子BM+PBSC | AB/B |
| 6 | 女 | 28 | AA-PNH | 3 | 322.5 | 无关PBSC | B/A |
| 7 | 男 | 28 | PNH | 6 | 926.8 | 单倍体同胞BM+PBSC | O/O |
| 8 | 男 | 23 | PNH | 3 | 17.6 | 同胞BM+PBSC | B/B |
| 9 | 男 | 13 | AA-PNH | 3 | 922.2 | 母亲BM+PBSC | B/O |
| 10 | 男 | 24 | AA-PNH | 48 | >1650.0 | 母亲BM+PBSC | A/A |
| 11 | 男 | 43 | AA-PNH | 120 | >1650.0 | 脐血/单倍体女儿UCB/BM+PBSC | AB/B |
| 12 | 男 | 16 | AA-PNH | 2 | 307.8 | 父亲BM+PBSC | A/A |
| 13 | 女 | 20 | AA-PNH | 2 | 118.5 | 单倍体同胞BM+PBSC | A/A |
| 14 | 女 | 40 | AA-PNH | 204 | >1650.0 | 同胞BM+PBSC | B/B |
| 15 | 男 | 47 | AA-PNH | 3 | 286.4 | 同胞BM+PBSC | A/A |
| 16 | 男 | 26 | AA-PNH | 24 | >1650.0 | 同胞BM | O/O |
| 17 | 男 | 30 | AA-PNH | 180 | 12.8 | 单倍体同胞BM+PBSC | B/O |
| 18 | 女 | 34 | PNH | 8 | 9.9 | 同胞BM+PBSC | B/B |
注：SF：血清铁蛋白；AA：再生障碍性贫血；BM：骨髓；PBSC：外周血造血干细胞；UCB：脐血
18例患者移植后均重建造血（例11首次双份脐血移植后2周因疱疹病毒感染导致植入失败，后行女儿单倍体相同供者移植，再获造血重建）。移植后粒细胞植入中位时间为+11（10～26）d，血小板植入中位时间为+15（10～120）d。分别比较原发PNH与AA-PNH患者、不同移植供者（单倍体相同/同胞/无关供者）、不同移植物来源（骨髓联合外周血干细胞/骨髓/外周血干细胞）、不同预处理方案（清髓性/非清髓性）各组间的粒细胞及血小板植入时间，差异均无统计学意义（P值均>0.05）。比较移植前不同SF水平患者（中位数926.8 μg/L），SF<926.8 μg/L与SF≥926.8 μg/L两组患者的粒细胞植入时间分别为（11.22±0.67）d、（13.56±4.92）d，血小板植入时间分别为（13.56±2.79）d、（28.80±34.69）d，差异均无统计学意义（P=0.196，P=0.225）。经STR、性染色体FISH及血型检测证实，所有患者移植后均获完全供者植入。
①GVHD：3例（17.6%）患者发生急性GVHD（aGVHD），其中Ⅱ度2例（单倍体相同供者移植），Ⅳ度1例（同胞相合供者移植）。随访超过100 d的16例可评价患者中2例（12.5%）发生局限型慢性GVHD（cGVHD）（单倍体相同供者移植）。②感染性并发症：移植后菌血症3例，病原菌分别为洛非不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌和放射根瘤菌，经拔除中心静脉置管及抗感染治疗后好转。并发肺部感染4例，肛周感染3例，中耳感染1例，皮肤黏膜疱疹感染1例（例11脐血移植后）。除例5肺部重症感染治疗无效死亡外，其余感染性疾病经相应的抗感染治疗后均好转。并发CMV血症3例，EBV血症2例，经更昔洛韦、膦甲酸钠及CD20单抗治疗后均转阴。③其他并发症：5例（22.2%）患者并发出血性膀胱炎（HC），其中单倍体相同供者移植3例，无关供者及同胞相合供者移植各1例，经抗病毒、碱化利尿及选择性髂内动脉介入栓塞术等治疗后好转；10例（55.6%）并发轻-中度消化道黏膜炎，对症处理均获好转；1例患者并发移植相关血栓性微血管病（TA-TMA）。
18例患者中死亡3例（17.6%），其中单倍体相同供者移植2例，相合同胞供者移植1例。例16为移植后100 d内并发激素耐药/难治型Ⅳ度aGVHD，经FK506、CD25单抗、TNF-α单抗及间充质干细胞等治疗无效，多脏器功能衰竭死亡。例11并发肺部CMV及细菌混合感染，于移植后6个月死亡。例5为肺部感染合并TA-TMA，于移植后12个月死亡。
15例存活患者随访血常规基本正常，定期FLAER流式细胞术检测分析外周血CD59/CD55阴性红细胞、粒细胞、单核细胞<5%，均达到临床痊愈标准[1]。随访至2015年3月1日，中位随访14.6（2.0～86.7）个月，预期5年无病生存（DFS）率为（80.5±10.2）%。其中单倍体相同供者移植者9例，中位随访14.0（4.0～30.8）个月，预期2年DFS率为（72.9±16.5）%。
PNH的现代治疗可大致分为非移植治疗和移植治疗。前者最有效药物为人源化抗C5单抗Eculizumab，可显著减少补体介导的血管内溶血，使得近1/2到2/3的患者脱离输血，明显减少输血依赖和血栓事件，甚至部分改变PNH的自然病程[3]。有学者推荐其作为有临床症状的经典型PNH的一线治疗[4]。但Eculizumab不能改善PNH的骨髓衰竭，也无法清除PNH克隆，还可能增加脑膜炎球菌感染的风险[5]。此外该药价格昂贵，不少国家仍无法获得（包括国内），难以广泛应用。allo-HSCT已证实可有效清除异常的PNH克隆而获得治愈效应[6]，只是早期对移植相关并发症和TRM的顾虑，部分限制了allo-HSCT在PNH中的开展。国内PNH移植治疗仍以个例报道居多[7,8,9]。
本组18例患者中以血管内溶血为主要临床表现和实验室检查阳性的AA-PNH占多数（14例）。近年来FLAER高灵敏度流式细胞术的常规开展，使得这类PNH患者被早期诊断的机会增加。此类患者一般多指AA-PNH，或国际PNH工作组分类的"骨髓衰竭背景下的PNH"[10]。国内外均建议此类合并造血衰竭的PNH患者应接受移植治疗[11,12]。以AA为突出临床表现、无或仅有轻微临床和溶血实验室证据的AA-PNH患者，一般按照AA方案进行治疗。
随着移植总体技术的进步，PNH患者的移植预后也在不断改善。Bemba等[6]报道1978至1995年48例同胞相合移植PNH患者2年OS率仅为56%。GITMO移植组回顾分析1998至2006年26例PNH移植患者10年OS率为57%[13]。近期EBMT的83个移植中心，随访211例PNH移植患者的5年OS率为（68±3）%[12]。本研究中18例患者，中位随访14.6个月，预期5年DFS率为（80.5±10.2）%，已初步显示出PNH移植疗效的进步。Lee等[14]最新报道HLA相合HSCT的20例AA-PNH患者，5年DFS率可达（90.0±6.7）%。鉴于移植疗效的提高，我们建议区分出可经移植治疗最大程度获益的PNH患者后，均应接受allo-HSCT治疗。
本研究中18例患者半数为单倍体相同供者，涵盖了父母、子女和单倍体同胞供者，显示了供者来源的多元化。对于PNH单倍体移植，我们以G-CSF动员的供者骨髓联合外周血干细胞作为移植物，采用改良BU/CY联合ATG方案进行清髓性及强化免疫抑制的预处理，获得100%的供者植入率，造血重建迅速，相关并发症及TRM均为临床可接受水平，9例单倍体相同供者移植者的预期2年DFS率达到（72.9±16.5）%。随着单倍体相同供者移植技术体系的进步，在恶性血液病已获得不逊于相合同胞供者移植的疗效。我们的研究结果也提示，PNH患者进行allo-HSCT时，如缺乏HLA相合同胞，单倍体相同供者可以和HLA相合无关供者平行选择。脐血移植治疗PNH报道尚少见[15]。其植入失败发生率相对较高，造血重建延迟。例11为43岁AA-PNH，首次为双份脐血移植，造血重建延迟，后感染疱疹病毒感染：发热、皮肤黏膜疱疹，致植入失败，最终行挽救性二次移植。考虑到AA-PNH的骨髓衰竭背景，骨髓微环境的损伤不利于造血细胞和T细胞数量均有限的脐血移植物植入。现阶段成人AA的移植治疗也不建议首选脐血为移植物。
本研究中我们的结果显示，原发PNH或AA-PNH、不同供者、不同移植物来源、是否清髓性预处理对造血重建均无明显影响。近年铁过载对移植患者的不良影响颇受重视，对移植前输血依赖的患者，铁过载不利于移植物植入及造血重建。本研究中铁过载患者移植前均接受了祛铁治疗，但限于时程不足，疗效受限。比较不同SF水平患者的造血植入，较高SF水平患者的血小板植入时间似较延迟，但未显示差异有统计学意义，不除外与病例数偏少有关。
既往PNH接受移植多受限于GVHD、植入失败等相关并发症，以及对较高TRM的担心。受益于总体移植技术的进步，本研究中aGVHD发生率为17.6%（3/18例），仅1例为Ⅳ度。可评价的16例患者中cGVHD发生率12.5%（2/16例），均为局限型。GITMO报道PNH移植后aGVHD及cGVHD发生率分别为42%、50%，其中Ⅲ～Ⅳ度aGVHD为12%，广泛型cGVHD为16%[13]。相比而言本研究GVHD发生率及严重程度较低，可能与多数患者采用清髓性预处理及联合ATG有关。PNH患者移植前多数有长期输血史，机体处于致敏状态，此类预处理优势在于最大程度清除受者免疫以及体内移植物去T细胞效应，但也相应增加了消化道黏膜炎、HC，以及后期感染的风险。3例死亡患者中2例与严重肺部感染有关（其中1例并发TA-TMA），1例为重度的激素耐药/难治型aGVHD，经二线、三线抗aGVHD治疗无效。提示在PNH移植治疗时，仍需高度重视感染、GVHD等并发症的防治。
综上所述，allo-HSCT对于有移植指征的PNH患者疗效确切，随着总体移植技术的进步，生存预后不断改善，在抗补体C5单抗尚未广泛应用的情况下，可作为有价值的一线治疗手段。
